مجهر القوة نتوء: أسلوب لتحديد حجم القوات المتقدمة بنتوءات الخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد قوى النتوء باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الشبكات المطلية بالصيغة أولا وقياس سمك هذا الفيلم. تتمثل الخطوة الثالثة من هذه العملية في جلوس الخلايا على الشبكات وتركها تلتصق.

الخطوة الأخيرة من الإجراء هي تصوير فيلم الشكل أسفل الخلايا باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية. عند الالتصاق بالركيزة ، تشكل الميكروفاج هياكل التصاق دون الميكرومترية تسمى بودوسوم. في النهاية ، سيتم قياس تشوه الفيلم المستخدم من قبل البودوسومات وتحويله إلى قوى باستخدام نموذج ميكانيكي محلي الصنع.

ضع ضوء زجاجي نظيف من الإيثانول في جهاز صب فيلم القمع وقم بتغطية الجزء العلوي من القمع. حرك محلول fomvar في القمع حتى يصل المستوى إلى ثلثي الشريحة. اتركه لمدة دقيقة واحدة ثم صفي محلول فورمفار في تيار مستمر.

لاحظ أن سمك الفيلم يعتمد على معدل التيار وتركيز محلول الفورمفار. جفف هذا الضوء بشكل داكن واقطع المستطيلات بشفرة حلاقة حادة. اغمس الشريحة في دورق مملوء بالماء المقطر حتى يطفو فيلم الفومفار على سطح الماء.

ضع شبكات الأسيتون النظيفة بعناية على الأفلام ، ووجهها لامع مع غطاء قطره 12 ملم فوق بعضها. سيتم استخدامها لتجربة تقييم السماكة. في النهاية قم بغمس شريحة مغطاة بالملصق لاستعادة الفيلم والشبكات بأكملها.

حدد الانزلاق المغطى بالزجاج بملاقط لقطع الصيغة وفصلها عن الشريحة. قم بتركيب موقع الشبكة أسفل الانزلاق المغطى ثم حدد الشبكة بالملاقط لسحبها. سيتم تصوير الثقب الموجود في فيلم fomvar الذي تم إنشاؤه على هذا النحو لقياس سمكه.

قم بتركيب نترات السيليكون في الكتلة الزجاجية AFM مع التأكد من أن الشريط الذهبي ليس أسفل طرف الزنبرك. قم بتركيب الكتلة الزجاجية على وحدة AFM ثم ضع الأخيرة على مرحلة المجهر. ضع زلة الغطاء المطلية بفومفار على غرفة المراقبة مع PBS في الأعلى.

امسح الحدود بين الفومفار والزجاج في وضع التلامس وبنقطة 0.5 نانو نيوتن. في برنامج معالجة البيانات ، استخدم السطح الزجاجي كمرجع للارتفاع ، وقم بقياس سمك الفومفار على المقطع العرضي. تحت غطاء معقم ، اختر زلة غطاء مقاس 12 ملم وقم بلصق شريط من الشريط الجانبي للفتحة عليه.

حدد الشبكة المطلية بفومافر بالملاقط وضعها ووجهها لامعا بحيث تلتصق جوانبها فقط بالمادة اللاصقة. هذا لمنع تمزق fomvar عند إزالة الشبكة من الشريط. ضع شريط الغطاء في صفيحة معقمة من ستة آبار وأنبوب في قطرة 10 ملم من وسط الثقافة الخالي من المصل.

يجب أن تحتوي على ما يقرب من 10 آلاف خلية وفي هذه الحالة ، هذه هي الميكروفاجات المتمايزة عن الخلايا الوحيدة البشرية. تأكد من عدم لمس الشبكة بطرف الممار في هذه العملية ، حتى لا تتلف طلاء fomvar. احتضن لمدة نصف ساعة للسماح للخلايا بالالتصاق ، ثم املأ البئر بوسط مكمل بالمصل ، واحتضنه مرة أخرى لمدة ساعتين ، قبل مراقبة AFM.

ضع شريطين متوازيين من الشريط اللاصق على الوجهين على طبق بتري زجاجي القاع ، وتأكد من أن العرض بينهما أصغر قليلا ، مقارنة بقطر الشبكة. ثم افصل الشبكة التي سبق زرعها بالخلايا وضعها فوق شريطي الشريط بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل. قم بإصلاح الشبكة عن طريق وضع شريطين آخرين فوق الشريطين السابقين.

املأ الطبق بوسط مزرعة مسخن مسبقا مع هيبي. ضع الطبق في سخان الأطباق المحدد مسبقا على 37 درجة مئوية. قم بتثبيت المجموعة على مرحلة AFM.

عندما تكون درجة حرارة النظام مستقرة عند 37 درجة مئوية ، انتقل إلى مسح سطح fomvar ، والذي يجب إجراؤه في وضع التلامس ، مع نقطة ضبط 0.95 نانو نيوتن ورؤية التشوهات المرتبطة بالأوليات على نافذة عرض بيانات الانحراف. فيما يلي النتائج التمثيلية وخطوات المعالجة لإنتاج التكوينات باستخدام AFM للقياسات الرسومية. كما ترون في هذه الصورة ، يتم الكشف عن انتفاخات على سطح fomvar.

من أجل تحويل هذه المعلومات الفوتوغرافية إلى قيم قوة ، من الضروري أولا الوصول إلى الفرق المحلي المرتفع. للقيام بذلك ، يجب طرح ملاءمة متعددة الحدود من الدرجة الثالثة إلى خط المسح الخاص بها بشكل مستقل. ثم يسمح استخدام خوارزمية صور مخصصة محلية الصنع بتقييم قيم قوة النتوء من خريطة ارتفاع AFM والنموذج الميكانيكي للنتوء بوساطة الأوليات.

بفضل هذا الإجراء ، نحن قادرون على التحقيق في الآليات التي ينطوي عليها توليد قوة النتوء في الأوليات. شكرا لك على المشاهدة ، ونتمنى لك الفرصة التوفيق لتجاربك.