مجهر القوة نتوء: أسلوب لتحديد حجم القوات المتقدمة بنتوءات الخلية
يونيو 16, 2018
هنا، نحن بالتفصيل الأساليب التجريبية المستخدمة لتقييم قوي نتوء بودوسوميس تنطبق على فيلم متوافقة، من إعداد الفيلم للتحليل الآلي للصور الطبوغرافية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد قوى النتوء باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الشبكات المطلية بالصيغة أولا وقياس سمك هذا الفيلم. تتمثل الخطوة الثالثة من هذه العملية في جلوس الخلايا على الشبكات وتركها تلتصق.
الخطوة الأخيرة من الإجراء هي تصوير فيلم الشكل أسفل الخلايا باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية. عند الالتصاق بالركيزة ، تشكل الميكروفاج هياكل التصاق دون الميكرومترية تسمى بودوسوم. في النهاية ، سيتم قياس تشوه الفيلم المستخدم من قبل البودوسومات وتحويله إلى قوى باستخدام نموذج ميكانيكي محلي الصنع.
ضع ضوء زجاجي نظيف من الإيثانول في جهاز صب فيلم القمع وقم بتغطية الجزء العلوي من القمع. حرك محلول fomvar في القمع حتى يصل المستوى إلى ثلثي الشريحة. اتركه لمدة دقيقة واحدة ثم صفي محلول فورمفار في تيار مستمر.
لاحظ أن سمك الفيلم يعتمد على معدل التيار وتركيز محلول الفورمفار. جفف هذا الضوء بشكل داكن واقطع المستطيلات بشفرة حلاقة حادة. اغمس الشريحة في دورق مملوء بالماء المقطر حتى يطفو فيلم الفومفار على سطح الماء.
ضع شبكات الأسيتون النظيفة بعناية على الأفلام ، ووجهها لامع مع غطاء قطره 12 ملم فوق بعضها. سيتم استخدامها لتجربة تقييم السماكة. في النهاية قم بغمس شريحة مغطاة بالملصق لاستعادة الفيلم والشبكات بأكملها.
حدد الانزلاق المغطى بالزجاج بملاقط لقطع الصيغة وفصلها عن الشريحة. قم بتركيب موقع الشبكة أسفل الانزلاق المغطى ثم حدد الشبكة بالملاقط لسحبها. سيتم تصوير الثقب الموجود في فيلم fomvar الذي تم إنشاؤه على هذا النحو لقياس سمكه.
قم بتركيب نترات السيليكون في الكتلة الزجاجية AFM مع التأكد من أن الشريط الذهبي ليس أسفل طرف الزنبرك. قم بتركيب الكتلة الزجاجية على وحدة AFM ثم ضع الأخيرة على مرحلة المجهر. ضع زلة الغطاء المطلية بفومفار على غرفة المراقبة مع PBS في الأعلى.
امسح الحدود بين الفومفار والزجاج في وضع التلامس وبنقطة 0.5 نانو نيوتن. في برنامج معالجة البيانات ، استخدم السطح الزجاجي كمرجع للارتفاع ، وقم بقياس سمك الفومفار على المقطع العرضي. تحت غطاء معقم ، اختر زلة غطاء مقاس 12 ملم وقم بلصق شريط من الشريط الجانبي للفتحة عليه.
حدد الشبكة المطلية بفومافر بالملاقط وضعها ووجهها لامعا بحيث تلتصق جوانبها فقط بالمادة اللاصقة. هذا لمنع تمزق fomvar عند إزالة الشبكة من الشريط. ضع شريط الغطاء في صفيحة معقمة من ستة آبار وأنبوب في قطرة 10 ملم من وسط الثقافة الخالي من المصل.
يجب أن تحتوي على ما يقرب من 10 آلاف خلية وفي هذه الحالة ، هذه هي الميكروفاجات المتمايزة عن الخلايا الوحيدة البشرية. تأكد من عدم لمس الشبكة بطرف الممار في هذه العملية ، حتى لا تتلف طلاء fomvar. احتضن لمدة نصف ساعة للسماح للخلايا بالالتصاق ، ثم املأ البئر بوسط مكمل بالمصل ، واحتضنه مرة أخرى لمدة ساعتين ، قبل مراقبة AFM.
ضع شريطين متوازيين من الشريط اللاصق على الوجهين على طبق بتري زجاجي القاع ، وتأكد من أن العرض بينهما أصغر قليلا ، مقارنة بقطر الشبكة. ثم افصل الشبكة التي سبق زرعها بالخلايا وضعها فوق شريطي الشريط بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل. قم بإصلاح الشبكة عن طريق وضع شريطين آخرين فوق الشريطين السابقين.
املأ الطبق بوسط مزرعة مسخن مسبقا مع هيبي. ضع الطبق في سخان الأطباق المحدد مسبقا على 37 درجة مئوية. قم بتثبيت المجموعة على مرحلة AFM.
عندما تكون درجة حرارة النظام مستقرة عند 37 درجة مئوية ، انتقل إلى مسح سطح fomvar ، والذي يجب إجراؤه في وضع التلامس ، مع نقطة ضبط 0.95 نانو نيوتن ورؤية التشوهات المرتبطة بالأوليات على نافذة عرض بيانات الانحراف. فيما يلي النتائج التمثيلية وخطوات المعالجة لإنتاج التكوينات باستخدام AFM للقياسات الرسومية. كما ترون في هذه الصورة ، يتم الكشف عن انتفاخات على سطح fomvar.
من أجل تحويل هذه المعلومات الفوتوغرافية إلى قيم قوة ، من الضروري أولا الوصول إلى الفرق المحلي المرتفع. للقيام بذلك ، يجب طرح ملاءمة متعددة الحدود من الدرجة الثالثة إلى خط المسح الخاص بها بشكل مستقل. ثم يسمح استخدام خوارزمية صور مخصصة محلية الصنع بتقييم قيم قوة النتوء من خريطة ارتفاع AFM والنموذج الميكانيكي للنتوء بوساطة الأوليات.
بفضل هذا الإجراء ، نحن قادرون على التحقيق في الآليات التي ينطوي عليها توليد قوة النتوء في الأوليات. شكرا لك على المشاهدة ، ونتمنى لك الفرصة التوفيق لتجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
توضح هذه المقالة التقنيات التجريبية المستخدمة لتحديد قوى البروز التي يطبقها البودوسوماس على فيلم مرن باستخدام مجهر القوة الذري. يشمل العملية تحضير الفيلم، التصاق الخلايا، والتصوير لتحليل التشوه الذي يسببه البودوسوماس.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- الفيزياء الحيوية
الخلفية
- البودوسوماس هي هياكل التصاق تحت مجهرية تشكلها الخلايا البلعمية.
- فهم القوى التي يمارسها البودوسوماس يمكن أن يوفر رؤى حول الميكانيكا الخلوية.
- مجهر القوة الذري هو تقنية رئيسية لقياس هذه القوى.
- تهدف الدراسة إلى تطوير نموذج ميكانيكي لتحديد القوى بناءً على تشوه الفيلم.
هدف الدراسة
- لتحديد قوى البروز التي يمارسها البودوسوماس.
- لتحليل التفاعل بين الخلايا والركائز الممتثلة.
- لتعزيز فهم آليات التصاق الخلايا.
الطرق المستخدمة
- تحضير شبكات مغلفة بالصيغة.
- قياس سماكة الفيلم.
- وضع الخلايا على الشبكات للتصاق.
- تصوير الفيلم أسفل الخلايا باستخدام مجهر القوة الذري.
النتائج الرئيسية
- تحديد كمي لتشوه الفيلم الذي يسببه البودوسوماس.
- تحويل قياسات التشوه إلى قيم قوة باستخدام نموذج ميكانيكي.
- رؤى حول الخصائص الميكانيكية لتفاعلات البودوسوماس مع الركايز.
- إثبات فعالية مجهر القوة الذري في قياس القوى الخلوية.
الاستنتاجات
- نجحت الدراسة في تحديد قوى البروز من البودوسوماس.
- تسهم النتائج في فهم الميكانيكا الخلوية والتصاق الخلايا.
- يمكن تطبيق الطرق التي تم تطويرها على مزيد من البحث في بيولوجيا الخلية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantifying protrusion forces provides a direct readout of cellular mechanical activity, enabling mechanistic de-risking in target validation for macrophage-related pathways. This method supports predictive confidence by linking subcellular force generation to functional phenotypes in adhesion and migration. It positions protrusion force measurement as a translational biomarker platform for preclinical model de-risking in immunology and inflammation programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying force generation from subcellular protrusive structures like podosomes.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct measurement of force-dependent cellular functions in human macrophages.
- Predictive Value: Links protrusion force dynamics to pathway clarification, aiding portfolio triage in mechanosensitive target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible nanoscale topography maps from compliant substrates for quantitative force extraction.
- Scalability: Enables preparation of validated biological systems (e.g., podosome-forming macrophages) for downstream compound screening.
- Platform Reuse: Facilitates reliable compound evaluation by providing a mechanical phenotype readout orthogonal to biochemical assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage protrusion force measurements to preclinical validation through disease-relevant macrophage models.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by quantifying force generation as a functional output of podosome activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by correlating protrusion force modulation with target engagement in adhesion pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing a quantitative, mechanistically grounded readout of cellular protrusion dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring force generation from defined protrusive structures.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible height maps from AFM imaging that enable quantitative comparison of protrusion forces across conditions.
- Analytics: Generates force values via mechanical model conversion of deformation profiles, enabling statistical comparison of protrusive activity.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using human macrophage-derived podosomes as a disease-relevant system for mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for probing mechanobiology across immune, cancer, and inflammation targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protrusion-driven processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through AFM-based nanoscale deformation mapping and controlled substrate preparation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early biological de-risking of targets involved in force-generating cellular structures.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying protrusion force as a functional biomarker for target modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in atomic force microscopy operation, compliant polymer film preparation, and macrophage cell culture.
- Depends on instrumentation capable of nanoscale height mapping and force curve acquisition in liquid environment.
- Necessitates cross-team standardization of film thickness measurement, cell seeding density, and AFM set-point force for reproducible protrusion detection.
- Involves adaptation considerations when applying to non-macrophage cell types or alternative protrusive structures beyond podosomes.
- Limited by the need for homogeneous, defect-free compliant films and accurate mechanical modeling of protrusion-substrate interactions.
