Name: عزل الخلايا الجذعية المعوية والثقافة في نموذج الخنزير من المجزأ الاسكيمية الأمعاء الصغيرة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: تعلم عزل الخلايا الجذعية المعوية وثقافتها في نموذج الخنزير من المجزأ الاسكيمية الأمعاء الصغيرة. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة آليات إصلاح النسيج الظهاري بعد الإصابات الإقفارية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وكان هذا المشروع الدعم من K01OD0199 المعاهد الوطنية للصحة، والمعاهد الوطنية للصحة T32 OD011130، P30DK034987 المعاهد الوطنية للصحة، وقسم العلوم السريرية نشر الأموال

لهذه التجارب، وقد أقر جميع الدراسات الحيوانية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ولاية كارولينا الشمالية.
1-التحضير للثقافة
ملاحظة: يتم سرد كافة الكواشف في الجدول للمواد. تركيزات عامل النمو محددة مدرجة في الجدول 1.
<ol><li>إعداد حل حمض (يدتا) الإيثيلين 0.5 متر في المياه المقطرة (ddH2س). مزيج كاف وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 استخدام محاليل هيدروكسيد الصوديوم و/أو HCl. ملاحظة: تشكل الحل الأسهم يدتا جديدة قبل كل تجربة.</li>
	<li>إعداد كاشف تفارق #1 (الدكتور #1) على النحو التالي ووضع على الجليد: الفوسفات الجمع مخزنة المالحة دون Ca2 + و Mg2 + (PBS)، 0.5 م يدتا، 1 م 1، 4-ديثيوثريتول (DTT)، 10 ميكرون Y27632 والحل س مضاد حيوي فطري 1 (مكافحة المضادة) تتضمن البنسلين والستربتوميسين والامفوتريسين باء ملاحظة: إضافة Y27632 قبل جمع الأنسجة مباشرة.</li>
	<li>إعداد كاشف تفارق #2 (الدكتور #2) على النحو التالي ووضع في حمام مائي 37 درجة مئوية: "الجمع بين برنامج تلفزيوني" دون Ca2 + و Mg2 +، يدتا 0.5 متر، 10 ميكرون Y27632 والمضادة لمكافحة س 1. ملاحظة: إضافة Y27632 قبل جمع الأنسجة مباشرة.</li>
	<li>تعد الخلايا الجذعية الظهارية المعوية (إيسك) وسائط الإعلام على النحو التالي: ميكس 25 مل متقدمة متوسطة DMEM/F12 مع الملحق X N2 1، الملحق 1 X B-27، 10 مم حبيس، 2 مم جلوتاماكس والمضادة لمكافحة س 1. تخزين في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.</li>
	<li>إعداد مزيج رئيسي لانخفاض النمو عامل الغشاء مصفوفة (مصفوفة) وعوامل النمو الإضافي كما يلي: ذوبان الجليد المصفوفة على الجليد. في أنبوب ميكروسينتريفوجي، إضافة 100 نانوغرام/مليلتر رأس الإنسان المؤتلف، 500 نانوغرام/مليلتر المؤتلف 1 R-سبوندين البشرية، 50 نانوغرام/مل الماشوب البشري البشرة عامل النمو (لو)، 100 نانوغرام/مل Wnt3a البشري المؤتلف، 10 مم نيكوتيناميد، 10 نانومتر جاسترين، 500 نانومتر A-83-01، 10 ميكرون Y-27632 ، 10 مم SB202190، 500 نانومتر LY2157299 و 2.5 ميكرون الجليكوجين synthase كيناز 3 المانع (GSK3i، CHIR99021). عندما يتم إذابة المصفوفة، مع استكمال هذا المزيج عامل النمو (صنع مزيج الرئيسي) وتخزينها على الجليد. ملاحظة: كن حذراً لتجنب إدخال فقاعات الهواء كما سيؤدي هذا إلى إنشاء قطعة أثرية داخل باتي مصفوفة أثناء الطلاء.</li>
	<li>قبل الحارة طبق استنبات الأنسجة 24-جيدا في حاضنة 37 درجة مئوية قبل البدء بإجراءات عزل الخلية.</li>
</ol>2-الجراحي النموذجي الاسكيمية، وجمع الأنسجة
<ol><li>نيوزيلند استخدام ثمانية إلى يوركشاير عمرها عشر الأسبوع الخنازير من أي من الجنسين (مستحسن). قم بإزالة جميع الأعلاف ح 16-18 قبل الجراحة. تسمح الخنازير للحصول على المياه في جميع الأوقات.</li>
	<li>جدولة الخنازير يصل إلى مالا يقل عن 48 ساعة قبل التجارب للسماح للتأقلم البيئي. ملاحظة: توفير فنيين مدربين في الطب البيطري و/أو المختبر تحت إشراف طبيب بيطري مرخص الرعاية الحيوانية الروتينية والمساعدة مع إجراءات مخدر.</li>
	<li>بريميديكاتي الخنزير مع إكسيلازيني (1.5 مغ/كغ عضليا (IM)) والكيتامين (11-20 مغ/كغ (IM))15. وبمجرد وقور، التنبيب أوروتراتشيلي خنزير.</li>
	<li>الحفاظ على الخنازير تحت التخدير العام مع إيسوفلوراني (2-5%) ويتبخر في 100% O2 حتى وقت القتل الرحيم.</li>
	<li>ضع قسطرة (رابعا) عن طريق الحقن الوريدي (الوريد الإذن الموصى بها) وإدارة سوائل استبدال مثل الحل قارعو الأجراس لاكتاتيد صيانة بمعدل 15 مل/كغ/ساعة.</li>
	<li>إجراء روتيني مخدر الرصد بما في ذلك pulse oximetry وكهربيه و قياسات ضغط الدم غير المباشرة15. رصد معدل التنفس للخنزير والجهد ويحققوا يدوياً أو آليا حسب الحاجة إذا كان نهاية المد CO2 ترتفع إلى 55-60 مم زئبق. ملاحظة: التخدير المناسبة ويتأكد من الرصد المستمر للاتجاهات في معدل ضربات القلب (مجموعة 80-130 نبضة/دقيقة)، وضغط الدم غير الغازية (يعني الضغط الشرياني 75-100 مم زئبق)، ومعدل التنفس (10-25 نفسا/دقيقة)16، والتدقيق الدوري لعدم وجود فكه ولهجة الشرج. يمكن أيضا الحكم على عمق التخدير بدرجة استرخاء العضلات وتليف العضلات بعد التحفيز الجراحية. عادة ما تكون ردود الفعل العين من لا قيمة16. ويمكن توفير التسكين حسب توجيهات السياسة IACUC المؤسسات. وفي هذه الحالة، يمكن أن تدار شبائه الأفيون، مثل البوبرينورفين، أثناء الجراحة.</li>
	<li>مكان في الخنزير على وسادة تدفئة وكبح جماح في ريكومبينسي الظهرية للعملية الجراحية.</li>
	<li>يحلق في البطن البطني والإعدادية باستخدام فرك الجراحية (محلول الكلورهيكسيدين) وكحول الأيزوبروبيل.</li>
	<li>جعل شق 8-10-سم البطني خط الوسط باستخدام شفرة المبضع تركزت في السرة للوصول إلى البطن.</li>
	<li>تحديد الفم الأمعاء (صائم) حوالي 40 سم إلى مفترق اللفائفيه. تحدد سم عشرة حلقات طويلة من صائم قبل circumferentially ligating الأمعاء مرتين، سم واحد بين كل حرف مزدوج، قبل إنشاء لاحقة حلقات 10 سم يقع شفويا (الشكل 1).</li>
	<li>إنشاء اثنين من الحلقات كل نقطة الوقت من الاسكيمية المجاورة لبعضها البعض، وواحدة الاسكيمية، وواحد الاسكيمية مع ح 1 إضافية من ضخه إذا رغبت في ذلك. لإنشاء الاسكيمية كاملة (أي تدفق للشرايين أو الأوردة)، المشبك أو سد المفرج المساريقي العلوي استخدام المشابك لدغ الأوعية الدموية أو منحنية هالستد البعوض هيموستاتس الحرير غير الامتصاص 2-0 ل 1، 2، 3 و 4 ح ومن ثم إزالة المشابك ح 1 من ضخه، إذا رغبت في ذلك. ملاحظة: الكتاب تم إنشاؤها جميع الحلقات من الاسكيمية بالترتيب بدءاً بحلقة الدماغية ح 4 وتقدم نقل بروكسيمالي (لتقليل وقت جراحة الكلي). للتصدي لإمكانية أن قطاعات الأمعاء الدماغية المجاورة قد تتلف الحلقات المتاخمة، يمكن أن تختلف ترتيب الحلقات الدماغية. وهذا قد يغير إجمالي الوقت الجراحية. ملاحظة: الإطار الزمني لضخه يمكن أن تختلف استناداً إلى البحوث مسألة الفائدة أو إذا كانت العلاجات ترغب في اختبارها خلال فترة ضخه. بيد تلف الأنسجة يصبح أكثر شدة من زيادة مدد الاسكيمية وحدها، ضخه الضرر المحتمل لا يسهم في زيادة الإصابة الظهارية. ضخه المرجح أن تقوم بدور عقب فترات معتدلة من الإصابات الدماغية.</li>
	<li>الفترات الفاصلة بين النقاط الزمنية الاسكيمية، الحفاظ على البطن تغطيتها أو إغلاق باستخدام منشفة عقيمة و/أو المشبك منشفة. ملاحظة: داخل حيوان وحيد لهذه التجربة، يمكن إنشاء ثمانية قطاعات الدماغية. تحديد جزء jejunal إضافية، على الأقل 5-10 سم الدانية إلى آخر حلقة الدماغية، التي ستكون بمثابة رقابة داخلية عادية.</li>
	<li>تعرقل حوالي ثلاث سفن المساريقي العلوي كل لدغ المشبك الأوعية الدموية أو منحنية هالستد البعوض هيموستات. يجب الحرص أثناء تطبيق هيموستات لأن هذه السفن هي صدمة بسهولة. محاولة المكدس بالسفن داخل الفكين المشابك.</li>
	<li>في نهاية هذه التجربة، القتل الرحيم التالية مع بينتوباربيتال الرابع 85-100 مغ/كغ، بجمع جميع الحلقات من الأنسجة باستخدام مقص ميتزينبوم، بعد أن تأكدت وفاة لا ضربات القلب أوسكولتاتيد وفقدان منعكس القرنية. ابدأ بجمع قطعة تحكم صائم العادي على الأقل 5-10 سم الدانية حلقة الدماغية الأخير.</li>
	<li>فصل وتخزين الحلقات من كل نقطة وقت الإصابة في حاويات صغيرة من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني حتى جاهزة لعزل سرداب. ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، جعل الدماغية الحلقات طويلة بما يكفي لتقسيم عينات منفصلة لعلم الأنسجة والخلايا الجذعية المعوية الثقافة؛ ومع ذلك، وجدت الكتاب أن الحلقات أكبر من طول 10 سم تقريبا الأكثر احتمالاً أن تصبح النزفية.</li>
</ol>3-سرداب (الخلايا الجذعية) في معزل عن الدماغية وحلقات التحكم
<ol><li>عكس كل حلقة من الأمعاء الدقيقة باستخدام أسلاك 20-قياس وملقط الأنسجة لفضح السطح المخاطي. ربط أعلى وأسفل الحلقة بشكل أمن إلى السلك باستخدام خياطة (2-0 الحرير غير الامتصاص أو ما يعادلها).</li>
	<li>وفي أعقاب الانقلاب، شطف كل حلقة في برنامج تلفزيوني الباردة الجليد لإزالة الحطام لومينال.</li>
	<li>وضع العينات فورا إلى 50 مل أنابيب مخروطية تحتوي على الدكتور #1 على الجليد لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>جمع الحلقات بدءاً من مراقبة ومتابعة مع الحلقات تدريجيا زيادة مدد الاسكيمية. يمكن اهتزت الحلقات من أقل الأنسجة التالفة (أي عنصر التحكم وح 1 الدماغية الأنسجة) قوة العض المعصم للحصول على أفضل النتائج. ينبغي هز الأنسجة من الأنسجة لحقت بها أضرار بالغة (ح 3 و 4 من الاسكيمية) بلطف أو مقلوب فقط كما تهتز كثيرا سوف يسبب تعطل سرداب وتدمير الأنسجة الإضافية. وينبغي أن اهتزت أنابيب أو مقلوب كل 5 دقائق في حين على الجليد.</li>
	<li>نقل العينات إلى الدكتور #2 لمدة 10 دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. اهتزاز أو عكس أنابيب كل 5 دقائق.</li>
	<li>بعد نقل الأنسجة، الطرد المركزي أنابيب مخروطية تحتوي على الدكتور #1 من الحلقات ح 2-4 أضرار لإزالة يدتا طافية (200 غ س لمدة 5 دقائق). كما تتلف هذه الأنسجة بدرجة عالية من الممكن الأقبية قد تصبح نات بالفعل. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني (5 مل) وانتقل إلى الخطوة 3، 9.</li>
	<li>إزالة عينات من الدكتور #2 ووضع عينات الأنسجة مباشرة إلى 25 مل من برنامج تلفزيوني الباردة على الجليد (التسمية كغسل #1). وضع العينات على شاكر مداري على الجليد في دورة في الدقيقة 60. ما زالت تهز أو عكس كل أنبوب لمدة 30 ثانية كل دقيقة 2 إلى 5.</li>
	<li>بعد نقل الأنسجة، تدور هذه الأنابيب المخروطية التي تحتوي على الدكتور #2 من ح 2-4 أضرار الحلقات لإزالة يدتا طافية (200 غ س لمدة 5 دقائق). كما تضررت هذه الأنسجة شديدة فمن الممكن أنه قد أصبح فصل في الأقبية. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني (5 مل) وانتقل إلى الخطوة 3، 9.</li>
	<li>إزالة من قاسمة 50 ميليلتر من يغسل #1 (أو من الدكتور) للتحقق من درجة الانفصال من سرداب وكمية من الحطام. وضع الأنسجة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد (أغسل #2، #3، إلخ) مليئة 25 مل الباردة برنامج تلفزيوني ويهز حتى الأقبية سليمة معزولة مع الحد الأدنى من الحطام والزوائد. ملاحظة: الهدف أن تكون قادرة على عزل جزء نظيف مع الأقبية سليمة والحد الأدنى من الحطام. كل غسل إضافية سوف تنظيف الخلايا تهتز ولكن الكثير سوف تبدأ أن ينجم عنه ضرر ثانوي الأنسجة/خلية. وعلاوة على ذلك، يتحقق أفضل النتائج مع أقل من التلوث إذا هي مطلي الأقبية من خطوة غسيل وليس من خطوة كاشف الانفصال.</li>
	<li>إزالة الأنسجة المتبقية والطرد المركزي هذه الأنابيب المخروطية 50 مل في 200 x ز لمدة 5 دقائق لإزالة المادة طافية، ثم ريسوسبيند المتبقية بيليه سرداب في حجم أصغر من برنامج تلفزيوني (5 مل).</li>
	<li>استخدام مجهر مقلوب، فحص 50 ميليلتر مختبرين لكل عينة لتحديد عدد من الأقبية/الكسر. والهدف هو 50-100 ميليلتر الخبايا/50، كما سيكون هذا حجم أتى المصفوفة النهائي. ملاحظة: إذا كانت العينة مركزة جداً، استمر في إضافة برنامج تلفزيوني الباردة حتى يتم الوصول إلى التركيز المطلوب. إذا كان نموذج مخفف جداً، تحديد عدد مختبرين اللازمة للوصول إلى سرداب المطلوب الغلة وضبط.</li>
	<li>الكوة وحدات مناسبة للأقبية (يحدده الملاحظات الكوة) في أنبوب ميكروسينتريفوجي. على سبيل المثال، إذا كان نموذج يحتوي على 50 الأقبية/50 ميليلتر ثم ميليلتر 50 الكوة الواحدة باتي يتطابق X 3 = 150 ميليلتر/أنبوب ميكروسينتريفوجي. إذا كان النموذج يحتوي فقط على 25 الأقبية/50 ميليلتر ثم 2 مختبرين الحاجة/يتطابق باتي X 3 = 300 ميليلتر/الأنبوبة.</li>
	<li>بيليه الأقبية في 200 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>ريسوسبيند برفق الأقبية الأعلاف مع حجم المناسبة من مزيج الرئيسي (50 ميليلتر للبئر الواحد). مزيج دقيق بسرعة بيبيتينج 15 مرة دون خلق فقاعات الهواء. ملاحظة: قبل بارد نصيحة ماصة مع PBS العقيمة الباردة قبل يسفط مزيج الرئيسي. وهذا سيساعد على الحفاظ مزيج الرئيسي من يتباعد. نصائح يمكن أيضا الاحتفاظ في الثلاجة ووضعها في غطاء محرك السيارة فورا قبل استخدامها.</li>
	<li>الاستغناء عن 50 ميليلتر ميكس الرئيسية بالإضافة إلى سرداب الحبرية إلى مركز لكل بئر من صفيحة جيدا 24 المعالجون مسبقاً.</li>
	<li>احتضان لوحة الثقافة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>تراكب كل أتى مصفوفة مع 500 ميليلتر/جيدا من إيسك الوسائط (لا نمو العوامل الإضافية اللازمة في اليوم 0 كما هي واردة ضمن مزيج الرئيسي).</li>
	<li>إضافة 500 ميليلتر PBS العقيمة إلى الآبار غير المستعملة أي اليسار في لوحة للحفاظ على رطوبة.</li>
	<li>عد عدد من الأقبية مطلي في اليوم 0. ملاحظة: أنها مفيدة للشبكة قبل كل خلية ثقافة لوحة في الأرباع للمساعدة على ضمان العد أكثر دقة.</li>
	<li>عد عدد من انتيروسفيريس كل 24 ساعة، ورصد للتنمية انتيرويد يوميا.</li>
	<li>إضافة عوامل النمو لكل حاء 48 جيدا كل إزالة الوسائط إيسك كل ح 96 واستبدال مع 500 ميليلتر وسائط جديدة (عوامل النمو يجب ثم إضافة إلى وسائل الإعلام).</li>
</ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14740765">Treatment of gastrointestinal ischemic injury.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemia-reperfusion-induced+intestinal+injury%3A+progress+and+promise+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).</li>
<li>Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immunity+and+inflammation.+V.+Innate+mechanisms+of+mucosal+defense+and+repair%3A+the+best+offense+is+a+good+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense.</a> Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).</li>
<li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology%2C+clinical+manifestations%2C+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li>
<li>Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+injury+of+the+intestine+and+protective+strategies+against+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury.</a> Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+models+of+digestive+disease%3A+the+future+of+large+animal+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research.</a> Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).</li>
<li>Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models%3A+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Meneses, A. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids-Current+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids-Current and future applications.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 31(2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).</li>
<li>Swindle, M. M., Smith, A. C. <a target="_blank" href="https://www.crcpress.com/Swine-in-the-Laboratory-Surgery-Anesthesia-Imaging-and-Experimental/Swindle-Smith/p/book/9781466553477">Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2015).</li>
<li>Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. <a target="_blank" href="https://trove.nla.gov.au/work/25432600">Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed</a>. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. (1995).</li>
<li>Parks, D. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+ischemia+and+reperfusion+to+mucosal+lesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation.</a> Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).</li>
<li>Schoenberg, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+neutrophils+in+postischaemic+damage+to+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine.</a> Gut. 32 (8), 905-912 (1991).</li>
<li>Nilsson, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+pathogenesis+during+ischemia+and+reperfusion+of+the+cat+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine.</a> Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).</li>
<li>Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ischemia%2Freperfusion+tolerance+in+the+rat+small+intestine.+An+epithelium-independent+event%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event.</a> J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).</li>
<li>Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+reperfusion+injury+an+important+cause+of+mucosal+damage+after+porcine+intestinal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia.</a> Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).</li>
<li>Shegarfi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CCN1+%28Cyr61%29+in+a+porcine+model+of+intestinal+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion.</a> Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).</li>
<li>Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27213580">Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

تطوير نموذج الاسكيمية المعوية قطعي النقانق ويتوسع نماذج مورين السابقة عن طريق السماح لدراسة نقاط زمنية متعددة من إصابة الأنسجة داخل الحيوان نفسه. وهناك عدة نقاط المناقشة الحاسمة لهذا البروتوكول بما في ذلك ربط السفن السليم وضخه الأنسجة وسرداب نجاح زراعة الخلايا.
ربط السفن السليم أمر ضروري لإيجاد نموذج الاسكيمية كاملة. إذا كانت مرتبطة الخياطة موزعة أو المشبك تشديد تماما، لا الدم من الشريان السميكة قد يستمر لإدخال الأنسجة ولا يمكن الخروج منه بسبب انهيار الوريد رقيقة الجدران. ينتج عن هذا التسرب دم إلى بروبريا الصفيحة يسبب تلف الأنسجة الإضافية. ومع ذلك، تبعاً لنوع الإصابة الدماغية قيد الدراسة، قد رغبت في الاسكيمية كاملة أو نزفية. على سبيل المثال، عملية زرع الأمعاء، يفصل الأمعاء تماما من إمدادات الأوعية الدموية (الشريان والوريد) أثناء مرحلة الاستئصال الداخلي، الذي ينتج الاسكيمية المعوية كاملة. بدلاً من ذلك، ومع ذلك، عندما هو الملتوية في مساريق أثناء حدث مثل انفتال الأمعاء، عودة وريدي هو غالباً ما أعاقت أولاً، المؤدية إلى الدم إضافية داخل الأنسجة قبل أن الإمداد الشرياني إعاقة، وبالتالي خلق الاسكيمية النزفية.
الإصابات الدماغية ينتج عن تلف الأنسجة بدءاً من طرف زغابة وتوسيع وصولاً إلى القاعدة من سرداب3. خلال الاسكيمية، لا تزال تستخدم الطاقة في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات ويولد هيبوكسانثيني المستقلب. عندما يتم ريبيرفوسيد الأنسجة بالأكسجين، يصبح استقلاب طريق أوكسيديز زانتيني hypoxanthine وتنتج الجذور الحرة دسموتاز مما أدى إلى إصابة الغشاء المخاطي والجذب من نسيج إتلاف العَدلات17،18. أنواع الاختلافات في بنية الأوعية المخاطية فضلا عن التعبير متفاوتة من أوكسيديز زانتيني، يؤدي إلى درجات متفاوتة من الإصابة ضخه3. نماذج القطط والقوارض من الاسكيمية-الاكسجينيه أكثر عرضه للإصابة ضخه من الأكسجين التفاعلية والايضات19،20. وفي المقابل، تم العثور على الخنازير أقل أوكسيديز زانتيني، وذلك أقل الإصابة ضخه، مما يجعل هذا النموذج أكثر قابلية للمقارنة لأن الاسكيمية المعوية البشرية21. في هذا الوقت، استخدام نماذج الخنزير المعدلة وراثيا لدراسة الإصابة المعوية أو خروج المغلوب لا وصف، مما يجعل هذا قيداً رئيسيا لهذا النموذج. اختيار النموذج الحيوان السليم يعتمد على عملية المرض أو شرط محدد الباحث يرغب في الدراسة. على سبيل المثال، كانت نماذج الخنزير من الإصابات الدماغية تصل إلى 6 ح22من وصف، بينما هي الإجراءات الأكثر الدماغية في نماذج مورين23من 45-60 دقيقة.
يسمح عزل ناجحة من الخبايا المعوية من الأمعاء إيشيميكالي التالفة والعادي للدراسة لاسترداد الظهارية في الثقافة. هذا النظام يسمح للباحث أن يركز فريد ظهارة وحدها، كما أن هناك إمدادات لا الأوعية الدموية أو مكونات الخلايا المناعية للنظر. وهذا يتيح الفرصة لدراسة التفاعلات بين الخلايا الظهارية والانتعاش بعد الإصابة بالإضافة إلى الاستجابة لعوامل النمو المختلفة، أو العلاجات التي يديرها أثناء الجراحة أو عزل سرداب التالية المكمل لوسائط الإعلام الثقافة. وتظل هذه الخطوة الأكثر صعوبة، كما تتطلب عزل من الحلقات لحقت بها أضرار بالغة تهز لطيف والإزالة السريعة للحلول التي تحتوي على يدتا في حال الأقبية تصبح قبل الأوان فصلها. إذا كانت هذه الحلقات من الأمعاء لا تغسل جيدا، الأقبية قد يمكن أن تصبح ملوثة في الثقافة. نتيجة لذلك تمت إضافة حل مضاد حيوي فطري إلى كلا الحلول الدكتور بالإضافة إلى وسائط الإعلام إيسك. نقطة نقاش أخرى تركز على الأمعاء التي يتم جمعها كعنصر تحكم عادي. الأنسجة التحكم حتى "طبيعية" كما الحيوانات الخضوع للتخدير مع التعديلات الممكنة في نضح الأنسجة النظمية، جنبا إلى جنب مع إمكانية تعميم وسطاء التهابات ثانوية الاسكيمية، قد لا تمثل عنصر تحكم حقيقية. في هذه التجارب، أنها ملاحظة أنه يبدو أن الأنسجة مراقبة مماثلة صارخ والأشيع للأنسجة من الحيوانات التي لم تطرأ الاسكيمية في تجارب أخرى (غونزاليس، ل. م.، معطيات غير منشورة، عام 2017).
وباختصار، يصف هذا الأسلوب نموذج استنساخه من الخنزير الاسكيمية المعوية، أن نماذج عن كثب ما يحدث في الإصابات الدماغية البشرية. بالإضافة إلى ذلك، يرد وصف لعزل الخلايا الجذعية المعوية من الحلقات الدماغية، الذي يعمل على دراسة إصلاح الظهارية واستجابة ممكنة للعلاج في الثقافة.

الإصابات الدماغية المعوية، ونتيجة لتوافر الأوكسجين انخفض بسبب تخفيض أو انسداد كامل لتدفق الدم إلى الأمعاء، ما زالت سببا هاما للمراضة والوفيات في المرضى الإنسان والحيوان1،2. الأضرار الدماغية، جنبا إلى جنب مع التهاب لاحقة وتسلل الخلوية، يؤدي إلى حل وسط الحاجز المخاطي. أن الحاجز المخاطي أمر حاسم لمنع إزفاء البكتيرية والسموم المرتبطة بها إلى الدوران الجهازي3،4. يمكن أن يؤدي تشكيل إلحاق الضرر بالأنواع الأكسجين التفاعلية التي يمكن أن تؤدي إلى تفاقم إصابة5ضخه اللاحقة من الأنسجة الدماغية. منذ الاسكيمية المعوية نادراً ما يمكن الوقاية منها، معظم الأبحاث الحالية تركز على النهوض بتقنيات الكشف المبكر عن الاسكيمية وتطوير رواية النهج العلاجية التي تقلل من ضخه الإصابة أو هدف إصلاح الغشاء المخاطي.
نماذج حيوانية قد استخدمت على نطاق واسع لتوسيع معرفتنا العلوم الأساسية من الإصابة ضخه الاسكيمية، وتظل الحتمية للبحوث متعدية الجنسيات. وكانت نماذج القوارض الأكثر استخداماً نظراً لقدرتها على أن تكون محوره وراثيا6. في الآونة الأخيرة بيد استخدام نماذج حيوانية كبيرة، على وجه التحديد الخنزير، قد دعت للدراسات متعدية الجنسيات في المستقبل نظراً لوجود عدد من المزايا بما في ذلك أوجه التشابه الخنازير التشريحية والفسيولوجية للبشر7،8. وقد وضعت مجموعة متنوعة من نماذج الضرر لدراسة الإصابة الاسكيمية-ضخه وتشمل انسداد الأوعية الدموية كاملة، الاسكيمية التدفق المنخفض وانسداد الأوعية الدموية المساريقي العلوي القطاعي. استعراضاً كاملا لهذه النماذج هو خارج نطاق هذه المقالة المباشر الكتاب القراء إلى مراجعة الأخيرة3.
ويتيح الاستخدام السابقين فيفو نظم الثقافة الخلوية بالإضافة إلى نماذج في فيفو ، أداة واعدة لدراسة التوازن المعوية وإصلاح بعد الإصابة. الأمعاء والخلايا الجذعية المسؤولة عن انتشار الهاتف الخلوي ودوران البطانة الظهارية المعوية. عندما معزولة من الأمعاء العادية أو الجرحى، الخلايا الجذعية المعوية يمكن الحفاظ على الثقافة، وتخدم كأداة أو نموذج لدراسة الخلايا الجذعية وبيولوجيا الخلايا الظهارية. طرق عزل وإقامة هذه ثلاثية الأبعاد الثقافة نظم (يطلق عليها انتيرويدس وكولونويدس عند المستمدة من الأمعاء الصغيرة والكبيرة، على التوالي) وقد وصف لمجموعة متنوعة من الجهاز وأنواع نظم9،10 11، ،،من1213. على وجه التحديد، داخل الجهاز الهضمي، استخدمت هذه النظم الثقافة إلى أمراض معوية نموذجية بما في ذلك السرطان والإصابة بمسببات الأمراض و مرض التهاب الأمعاء14. وفي هذا الوقت، لا توجد تقارير تصف بالعزلة والحفاظ على الخلايا الجذعية المعوية من إيشيميكالي إصابة الأمعاء الدقيقة في أي من الأنواع. ولذلك، نحن هنا وصف عملية الاسكيمية المعوية في الرواية كبير حيوان الخنزير نموذج، مما يسفر عن إصابة استنساخه والقدرة على عزل الخلايا الجذعية المعوية من الأمعاء العادية والمصابين إيشيميكالي لدراسة إضافية استرداد السابقين فيفو.

<table><tbody><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، Ca2 + ، Mg 2+ مجاني</td><td>فيشر Scientific &nbsp ؛</td><td>BP-399</td><td>مخفف 1:10</td></tr><tr><td>ماء مقطر منزوع الأيونات (ddH2O)</td><td></td><td></td> <td>يستخدم لتحضير EDTA و PBS</td></tr><tr><td>ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) Thermo</td> <td>Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين ديامين (EDTA)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>ED45</td><td>اجعله طازجا قبل كل تجربة ؛ درجة الحموضة 7.4</td></tr><tr><td>1،4-Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM / F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Supplement Life</td><td>Technologies 17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Supplement Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين / الستربتومايسين / الأمفوتريسين ب</td><td>جيبكو</td><td>15240-096</td><td>محلول مضاد</td></tr> مضاد <tr><td>مؤتلف بشري Wnt-3a</td><td>R & D Systems</td><td>5036 WN / CF</td><td></td></tr><tr><td>المؤتلف البشري Rspondin1</td><td>R & D Systems</td><td>4645- RS</td><td></td></tr><tr><td>مؤتلف الإنسان Noggin</td><td>R & D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>المؤتلف البشري EGF</td><td>R & D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>كايمان كيميكال</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>الإنسان [leu] 15-Gastrin 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>حمض الخليك</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>المياه ، WFI Quality</td><td>Corning، Inc.</td><td>25-055-سم</td><td>يشار إليها باسم الماء المعقم (SW) ؛ لمخزون عامل النمو</td></tr><tr><td>ألبومين مصل الأبقار (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix ، GFR</td><td>Corning، Inc.</td><td>356231</td><td>الفينول الأحمر الخالي</td></tr><tr><td>من 24 Well Culture Dish</td><td>Corning، Inc.</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>أنبوب مخروطي ، 50 مل &nbsp ؛</td><td>شركة كورنينج</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>مقبض مشرط</td><td>الأدوات الدقيقة العالمية</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>شفرة جراحية من الصلب الكربوني ، رقم 10</td><td>أدوات الدقة العالمية</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>ملقط الأنسجة</td><td>العالمية للأدوات الدقيقة</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>ملقط الأنسجة Debakey</td> الأدوات <td>الدقيقة العالمية</td><td>501239</td><td></td></tr> Mayo <tr><td></td><td>Scissors World أدوات دقيقة</td><td>501752</td><td></td></tr><tr><td>مقص Metzenbaum</td> منحني أو مستقيم أدوات <td>الدقة العالمية</td><td>501739</td><td></td></tr><tr><td>ملقط البعوض ،</td><td>أدوات الدقة العالمية</td> المنحنية <td>503724-12</td><td>منحنية أو مستقيمة (503728-12)</td></tr> شركة <tr><td>هوبكنز بولدوج المشبك</td><td>ستويلتينج</td><td>52120-40P</td><td>حرير مستقيم</td></tr><tr><td>, 2-0&nbsp;</td><td>Henry Schein</td><td>685S-BUT</td><td>أي علامة تجارية مماثلة مقبولة</td></tr><tr><td>Towel Clamps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>حامل إبرة</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>خياطة الأسلاك ، 20 مقياس</td><td>Henry Schein</td><td>19075</td><td>قص وتصويب قبل الاستخدام.</td></tr><tr><td>المناشف الجراحية</td><td>Henry Schein</td><td>ST1833</td><td>أي منتج مماثل مقبول.</td></tr><tr><td>محلول الرنين اللواتي</td><td>ليكد هنري شاين</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>مقشر مطهر كلورهيكس (4٪)</td> <td>هنري شاين</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>أي علامة تجارية مماثلة</td></tr> مقبولة <tr><td>كحول الأيزوبروبيل 70٪</td> <td>هنري شاين</td><td>MS071HS</td><td>أي علامة تجارية مماثلة مقبولة</td></tr><tr><td>قسطرة IV ، 22 قياس</td><td>Henry Schein</td><td>2225PUR</td><td>قد تحتاج إلى 20 جراما أو 24 جراما حسب حجم الوريد</td></tr><tr><td>زيلازين (100 مجم / مل)</td> <td>هنري شاين</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>كيتامين (100 مجم / مل) هنري</td> <td>شاين</td><td>11695-6835-1</td><td>دواء خاضع للرقابة</td></tr><tr><td>محلول الأيزوفلوران</td><td>هنري شاين</td><td>10015516</td><td></td></tr><tr><td>بنتوباربيتال (محلول القتل الرحيم القاتل (390 مجم / مل))</td> <td>فورتيك فارم.</td><td></td><td>تتوفر ماركات متعددة من Pentobarbital Sodium</td></tr><tr><td>وسادة التدفئة&nbsp;</td>نظام الاحترار الأساسي <td>Gaymar</td><td></td><td>Tpump ؛ البعض الآخر متاح.</td></tr><tr><td>Mindray Datascope Monitor</td><td>Mindray أمريكا</td><td></td> الشمالية <td>أي قطعة مكافئة من معدات المراقبة مقبولة</td></tr><tr><td>Vaporizer &nbsp ؛</td>أوصت <td>Vetland Medical</td><td></td><td>باستخدام نظام الدائرة مع قطعة Y ؛ العديد من الموردين المتاحين.</td></tr><tr><td>مضخة السوائل</td><td>أبوت هوسبيرا</td><td></td><td>بلوم A + ؛ يوصى بأي مصنع مماثل.</td></tr></tbody></table>

عزل الخلايا الجذعية المعوية والثقافة في نموذج الخنزير من المجزأ الاسكيمية الأمعاء الصغيرة

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

ويظل الاسكيمية المعوية سببا رئيسيا للمراضة والوفيات في المرضى البشرية والبيطرية. تؤدي العديد من الأمراض العمليات في الاسكيمية المعوية، عندما انخفضت إمدادات الدم، وبالتالي الأكسجين للامعاء. هذا يؤدي إلى فقدان جدار الأمعاء والأضرار التي لحقت الأنسجة الكامنة. تتواجد في قاعدة الخبايا Lieberkühn الخلايا الجذعية المعوية وهي المسؤولة عن تجديد المعوية خلال التوازن والإصابات التالية. وأتاحت دراسة التفاعلات بين الخلايا الجذعية الظهارية ناجحة السابقين فيفو تقنيات استزراع خلية بوضع شروط الثقافة التي تدعم نمو النظم مثل جهاز الظهارية ثلاثي الأبعاد (يسمى "انتيرويدس" و " كولونويدس "من الأمعاء الصغيرة والكبيرة، على التوالي). هذه انتيرويدس مكونة من سرداب ومجالات مثل زغابة وناضجة لاحتواء كافة أنواع الخلايا وجدت داخل الظهارة. تاريخيا، استخدمت نماذج مورين لدراسة الإصابة المعوية. ومع ذلك، يقدم نموذجا الخنزير العديد من المزايا بما في ذلك تشابه الحجم فضلا عن تشريح الجهاز الهضمي وعلم وظائف الأعضاء للبشر. باستخدام نموذج الخنزير، يمكننا وضع بروتوكول التي قطعي حلقات من الأمعاء الاسكيمية يمكن أن تنشأ داخل حيوان مفردة، وتمكن الدراسة من اختلاف الوقت النقاط من الإصابات الدماغية وإصلاح فيفو. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا وصف طريقة لعزل والثقافة أن الخلايا الجذعية المعوية من الحلقات الدماغية من الأمعاء، مما يسمح لمواصلة دراسة إصلاح الظهارية، عن طريق الخلايا الجذعية، والتضمين السابقين فيفو.

تم إنشاؤه الاسكيمية المعوية كاملة في حلقات الأمعاء الصغيرة عن طريق استخدام انسداد الأوعية الدموية مع خياطة أو المشابك كما هو مبين في الشكل 1. عن طريق الإفراج عن المشابك، يمكن أن يؤديها فترة ضخه الخاضعة لمراقبة، مما يسمح لدراسة إضافية للإصابة ضخه اللاحقة إذا رغبت في ذلك. ونجا جميع الحيوانات أثناء الإجراء مع الحد الأدنى من المضاعفات حتى القتل الرحيم. المضاعفات الجراحية الأكثر شيوعاً هو انخفاض ضغط الدم، التي تحل مع مكملات من المقوى إيجابية مثل الدوبوتامين.
إذا أجرى بشكل صحيح، سوف تبدأ في غيض الزوائد المعوية الإصابات الدماغية وتهاجر إلى أسفل داخل السرداب كفترة زيادات الاسكيمية (الشكل 2). يمكن أن يحدث خطأ مشترك واحد مع تقنية جراحية عندما الأوعية الدموية غير متصلة أو فرضت بالتساوي. والنتيجة هي الاسكيمية نزفية (الشكل 3)، الذي ينهار على المنوال رقيقة الجدران قبل الشريان، مما يسمح للدم الإضافية اختراق الأنسجة. ويعتبر هذا صارخ على سطح سيرسال أرجواني داكن (الرقم 3من اليسار) بالمقارنة مع سطح اشحب خلال كامل الاسكيمية (الشكل 3، حق).
وبعد إزالة الحلقات المعوية الدماغية، الخبايا المعوية كانت معزولة بنجاح عقب الانفصال من البروتوكول (الشكل 4). كما هو متوقع، كثيرا ما كانت أقبية من تيميبوينتس التالفة أكثر شدة مكسورة (و؛ بلغة) ويرد الكسور القبو أكثر الحطام الخلوية في الخلفية عند مقارنتها بتلك التي خضعت للا أضرار خفيفة. خلال البروتوكول، يجب أن تهتز الأمعاء إصابة شديدة برفق لتجنب المزيد من الضرر للأنسجة الكامنة. هز جداً تقريبا يمكن أن يؤدي المزيد من سرداب الأضرار والغالبية من أقبية ينتهي بهم المطاف في الحلول الدكتور المحتوية على يدتا، أسفر عن تعطل إضافية.
وبمجرد مطلي، الأقبية من جميع النقاط الزمنية من الاسكيمية البقاء على قيد الحياة وقادرون على ترسخ في الثقافة (الشكل 5). عندما يتم مطلي الخبايا المعوية العادية وتلف أقل ما يقال في الثقافة، ونموذج انتيروسفيريس داخل ح 24-48. مع أضرار الدماغية (ح 3 و 4)، الخبايا المعوية البقاء على قيد الحياة، لكن معطوبة، أسفر عن تشكيل المجالات أصغر بكثير في البداية. من ح 72-120، انتيرويدس أصبحت أكثر تعقيداً مع لومن مركزية واضحة وهياكل مهدها. وعموما، هناك من كفاءة نمو انخفض من أقبية، فضلا عن انخفاض حجم انتيرويدس المستمدة من الأنسجة المعوية لحقت بها أضرار بالغة (غونزاليس، ل. م.، معطيات غير منشورة، عام 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> الشكل 1 : نموذج الجراحية من الاسكيمية المعوية كاملة في نموذج خنزيري. A) الطبيعي صائم الخنزير اكستيريوريزيد. ب) وقد كانت متصلة سفن المساريقي العلوي مع خياطة خلق الاسكيمية المعوية. ج) الاسكيمية التي تم إنشاؤها باستخدام المشابك لدغ الأوعية الدموية للسماح للأنسجة ضخه إذا رغبت في ذلك. د) المعوية المفرج فور إزالة المشابك الأوعية الدموية. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> الشكل 2 : الأدلة النسجية (الهيماتوكسيلين وويوزين وصمة (H &amp; E)) لزيادة الأضرار الظهارية بعد فترات أطول من الاسكيمية المعوية كاملة- يبدأ الضرر في غيض الزوائد مع فقدان تدريجي طبقة طلائي خلية مفردة، وأحبطت زغابة والأضرار الخلوية توسيع وصولاً إلى سرداب قاعدة مع إصابة شديدة (لمدة تصل إلى 4 ح). شريط مقياس 100 ميكرومتر. أنا = الاسكيمية. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> الشكل 3 : الأدلة الإجمالية ونسيجية من الاسكيمية النزفية. A) الصورة الإجمالي مقارنة الاسكيمية النزفية (حلقة الأيسر) وكامل الاسكيمية (حلقة الحق). عند المفرج غير متصلة أو فرضت بالتساوي، الدم يمكن الاستمرار في التسلل الأنسجة، مما يؤدي إلى التهاب إضافية والضرر. ب) صور الاسكيمية النزفية من زيادة المدة من 1-4 ح ح &amp; ه. بالإضافة إلى الأضرار الخلوية ينظر مع الاسكيمية كاملة، هناك دليل على تسلل خلايا الدم الحمراء داخل بروبريا الصفيحة المحيطة بها. شريط مقياس 100 ميكرومتر. أنا = الاسكيمية. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> الشكل 4 : مختبرين الخبايا المعوية المعزولة من حلقات الأمعاء الدماغية وعادي. الخبايا المعوية كاملة وسليمة (علامات نجمية) كانت معزولة بنجاح من كل حلقة من الأمعاء. كما هو متوقع، الأقبية من أكثر النقاط الزمنية لحقت بها أضرار بالغة كثيرا ما تكون مقطوعة (و؛ يفتت) ويرد الكسور القبو أكثر الحطام الخلوية في الخلفية عند مقارنتها بتلك التي خضعت للا أضرار خفيفة. شريط مقياس 100 ميكرومتر. أنا = الاسكيمية. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> الشكل 5 : دورة الوقت لنمو الخلايا الجذعية المعوية بعد عزلة من الحلقات الدماغية من الأمعاء. عندما كانت مطلي الخبايا المعوية العادية في الثقافة، شكلت انتيروسفيريس داخل ح 24-48. مع أضرار الدماغية (ح 3 و 4)، الأقبية البقاء على قيد الحياة، لكن تشكل مجالات أصغر بكثير في البداية. من ح 72-120، انتيرويدس أصبحت أكثر تعقيداً مع لومن مركزية واضحة وهياكل مهدها. 20 ميكرون حجم شريط ما سجلته. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>عامل النمو</td>
			<td>مخفف</td>
			<td>تركز الأسهم</td>
			<td>تمييع الأسهم</td>
			<td>تمييع العمل</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-سبوندين</td>
			<td>برنامج تلفزيوني</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 ميكروغرام/مل</td>
			<td>1 ميكروغرام/مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>رأس</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 ميكروغرام/مل</td>
			<td>100 نانوغرام/مليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>لو</td>
			<td>10 ملم حمض الخليك</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>500 ميكروغرام/مل</td>
			<td>50 نانوغرام/مليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>ألف-83-01</td>
			<td>[دمس]</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 ميكرومتر</td>
			<td>500 نانومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>[دمس]</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 مم</td>
			<td>10 ميكرومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>نيكوتيناميد</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>م 1</td>
			<td>1 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>جاسترين</td>
			<td>برنامج تلفزيوني</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>100 ميكرومتر</td>
			<td>10 نانومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>برنامج تلفزيوني</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 ملم</td>
			<td>10 ميكرومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>[دمس]</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>5 مم</td>
			<td>0.5 ميكرومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>برنامج تلفزيوني</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2.5 مم</td>
			<td>2.5 ميكرون</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>برنامج تلفزيوني</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 ميكروغرام/مل</td>
			<td>100 نانوغرام/مليلتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: جدول الكاشف عامل نمو. ملخص الحلول الأسهم عامل النمو وعمل الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

وسيمكن هذا البروتوكول للقراء بنجاح إنشاء نموذج الاسكيمية المعوية قطعي النقانق وبعد ذلك عزل والثقافة المعوية الخلايا الجذعية لدراسة إصلاح الظهارية بعد إصابة.

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم آثار نقص التروية المعوية على الخلايا الجذعية الظهارية المعوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية ، مثل كيفية مقاومة الخلايا الجذعية للإصابة والمساهمة في الإصلاح بعد الإصابة الإقفارية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها نموذج حيواني كبير يمكن استخدامه لدراسة أمراض الأمعاء السريرية وإصلاحها.ستظهر الإجراء إيمي ستيلر ستيوارت ، طالبة دراسات عليا ، وجون فرويند ، أخصائي أبحاث من مختبري. ابدأ باستخدام شفرة مشرط لعمل شق بطني في خط الوسط من ثمانية إلى 10 سنتيمترات على البطن متمركزا في سرة خنزير يوركشاير مهجن يبلغ من العمر ثمانية إلى 10 أسابيع. حدد موقع الصائم ، حوالي 40 سم عن طريق الفم إلى التقاطع اللفائفي.اربط الأمعاء بشكل محيطي مرتين لتحديد حلقات الصائم بطول 10 سنتيمترات مع سنتيمتر واحد بين كل رباط قم بإنشاء حلقتين لكل نقطة زمنية من نقص التروية متجاورة لبعضهما البعض ، واحدة للإقفار والأخرى للإقفار مع ساعة إضافية من إعادة التروية. للحث على نقص تروية كاملة قابلة للانعكاس ، استخدم مشابك الأوعية الدموية البلدغية أو المرقئ لعرقلة ما يقرب من ثلاث أوعية مساريقية لكل مشبك للفترة الزمنية التجريبية المناسبة.حافظ على تغطية البطن طوال فترة الإقفار. في نهاية التجربة ، استخدم مقص Metzenbaum أولا لجمع قطعة تحكم من الصائم العادي على الأقل من خمسة إلى 10 سنتيمترات قريبة من آخر حلقة إقفارية ، متبوعة بجمع بقية الحلقات. قم بتخزين الحلقات من كل نقطة زمنية للإصابة في حاويات صغيرة من PBS المثلج حتى عزل القبوة.لعزل الخلايا الجذعية للسرداب ، استخدم سلكا عيار 20 ملقطا للأنسجة لقلب كل حلقة من الأمعاء الدقيقة بحيث يتعرض سطح الغشاء المخاطي. قم بخياطة الجزء العلوي والسفلي من كل حلقة بإحكام على السلك ، واشطف كل حلقة مقلوبة في PBS مثلج. عندما تتم إزالة كل الحطام اللمعي ، ضع العينات على الفور في أنابيب مخروطية فردية سعة 50 مليلتر تحتوي على 30 مل من كاشف التفكك رقم واحد على الجليد لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز والانعكاس كل خمس دقائق.في نهاية فترة الحضانة ، قم بنقل العينات إلى أنابيب 50 مليلتر مقابلة تحتوي على 30 مل من كاشف التفكك رقم اثنين وحبيبات عينات الحلقة الإقفارية من ساعتين إلى أربع ساعات عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الكريات في خمسة ملليلتر من PBS واستخدم 50 ميكرولتر من كل عينة للتحقق من درجة ارتباط القبو وكمية الحطام بواسطة المجهر الضوئي. بعد ذلك ، ضع العينات في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع الاهتزاز أو الانعكاس كل خمس دقائق.ثم انقل العينات مباشرة إلى 25 مل من PBS المثلج البارد على الجليد في شاكر مداري مضبوطة على 60 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق من الاهتزاز مع اهتزاز يدوي إضافي أو انعكاس كل 30 ثانية. في نهاية حضانة الاهتزاز ، تحقق من درجة ارتباط القبو وكمية الحطام وانقل العينات إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 مليلتر تحتوي على 25 مل من PBS البارد للاهتزاز حتى يتم عزل الخبايا السليمة بأقل قدر من الحطام والزغابات. عندما يتم فصل الحلقات تماما ، قم بإزالة الأنسجة المتبقية ، وحبيبات العينات عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق كريات القبو المتبقية في خمسة ملليلتر من PBS الطازج.ثم قم بنقل 150 سردابا لكل أنبوب في أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية وحبيبات الخبايا عن طريق الطرد المركزي الدقيق. باستخدام ماصة مبردة مسبقا، أعد تعليق الكريات برفق باستخدام 50 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل بئر متبوعا بسحب سريع 15 مرة للخلط. بعد ذلك ، قم بتوزيع قطرة سرداب سعة 50 ميكرولتر في وسط كل بئر من صفيحة 24 بئر مسبقة الديدان وشبكية وضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية.بعد 30 دقيقة ، قم بتراكب كل فطيرة مصفوفة ب 500 ميكرولتر لكل بئر من وسط الخلايا الجذعية الظهارية المعوية مع إضافة 500 ميكرولتر من PBS المعقم إلى أي آبار غير مستخدمة للحفاظ على الرطوبة وحساب عدد الخبايا المطلية باليوم الصفر. أضف عوامل النمو إلى كل بئر كل 48 ساعة ، واستبدل المادة الطافية كل 96 ساعة ب 500 ميكرولتر من الوسط الطازج المكمل بعامل النمو. يتم إنشاء نقص تروية الأمعاء الكامل في حلقات معوية دقيقة من خلال استخدام انسداد الأوعية الدموية بالخيوط أو المشابك ، كما هو موضح.إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، فستبدأ الإصابة الإقفارية عند طرف الزغابات المعوية وتهاجر داخل القبو مع زيادة مدة نقص التروية. يمكن أن يحدث أحد الأخطاء الشائعة في التقنية الجراحية عندما تكون الأوعية الدموية غير مربوطة أو مثبتة بالتساوي ، مما يؤدي إلى نقص تروية نزفي ينهار فيه الوريد ذو الجدران الرقيقة قبل الشريان ، مما يسمح لدم إضافي بالتسلل إلى الأنسجة. بعد إزالة الحلقات المعوية الإقفارية ، يمكن عزل الخبايا المعوية بنجاح باتباع بروتوكول التفكك كما هو موضح للتو.غالبا ما يتم كسر الخبايا من النقاط الزمنية الأكثر تضررا وتحتوي على المزيد من الحطام الخلوي الخلوي مقارنة بتلك التي لا تتعرض لأي ضرر أو طفيف. عندما يتم طلاء الخبايا المعوية الطبيعية والتالفة بشكل طفيف في الثقافة ، تتشكل الأمعاء في غضون 24 إلى 48 ساعة. مع التلف الإقفاري الشديد ، تبقى الخبايا المعوية على قيد الحياة ولكنها تتلف مما يؤدي إلى تكوين كرات أصغر بكثير في البداية.بحلول 72 إلى 120 ساعة ، تصبح الأمعاء المعوية من جميع الخبايا أكثر تعقيدا مع التجويف المركزي الواضح والهياكل الناشئة ، ومع انخفاض كفاءة نمو القبو بشكل عام ، بالإضافة إلى انخفاض الحجم في الأمعاء المشتقة من أنسجة الأمعاء المتضررة بشدة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال إجراءات طلاء عزل القبو في حوالي ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. من الأفضل أن تكون الخبايا التي تم جمعها للطلاء مشتقة من الغسالات وليس من كسور الانفصال بسبب زيادة احتمالية تلوث الثقافة في جزء الانفصال.يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لاختبار فعالية الأدوية لعلاج الإصابات الظهارية الناتجة عن نقص التروية زائد أو ناقص إعادة التروية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الجهاز الهضمي لاستكشاف تأثير نقص التروية على الظهارة على وجه التحديد على الخلايا الجذعية المعوية في نموذج حيواني كبير متعددي ذي صلة سريريا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نقص تروية معوي مع أو بدون إعادة التروية وكذلك لعزل الخبايا المعوية لثقافة ثلاثية الأبعاد بعد الإصابة في الجسم الحي.

intestinal-stem-cell-isolation-culture-porcine-model-segmental-small

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

هذه المادة والفيديو المصاحبة لدينا هذا البروتوكول لتوليد أنسجة الأمعاء الهندسة في الماوس، وذلك باستخدام وحدات عضي على اساس سقالة النهج.

هندسة الأنسجة من الأمعاء في نموذج الفئران

نحن هنا وصف الإجراء مفصل من الأمعاء نقص التروية ضخه في الفئران مما يؤدي إلى الإصابة استنساخه دون وفيات لتشجيع توحيد هذه التقنية عبر الميدان. ويمكن استخدام هذا النموذج من الأمعاء إصابة نقص التروية ضخه لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للإصابة والتجدد.

نموذج الفئران من المعوية الإسكيمية-ضخه إصابة

يقدم هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لإنشاء عضويات الأمعاء الدقيقة الفئرانية ، وعزل الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 1 من الأمعاء الدقيقة الفئرانية الصفيحة propria، وإنشاء مزارع مشتركة ثلاثية الأبعاد (3D) بين كلا النوعين من الخلايا لدراسة التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا الظهارية المعوية والخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 1.

المشاركة في زراعة الأعضاء الظهارية في الأمعاء الدقيقة الفئرانية مع الخلايا اللمفاوية الفطرية

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل اللحمة المتوسطة المعوية للفئران ، بما في ذلك الخلايا الطرفية. يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات ، مثل الزراعة المشتركة مع الفئران أو الكائنات العضوية المشتقة من الإنسان ، لدعم النمو وتعكس بشكل أفضل الوضع في الأنسجة الأصلية.

عزل اللحمة المتوسطة المعوية للفئران مما يؤدي إلى غلة عالية من الخلايا التيلوسيتية

وصفنا كيفية إنشاء نموذج جراحي مستخدم على نطاق واسع لإصابة نقص التروية المعوية (IRI) في القوارض. يتضمن الإجراء انسداد الشريان المساريقي العلوي متبوعا باستعادة تدفق الدم. هذا النموذج مفيد للدراسات التي تبحث في أسباب انسداد IRI المعوي في كل من الطب البيطري والبشري.

نموذج القوارض لإصابة نقص التروية المعوية عن طريق انسداد الشريان المساريقي العلوي

يصف البروتوكول الحالي إنشاء نظام عضوي قولوني للفئران لدراسة نشاط وعمل الخلايا الجذعية القولونية في نموذج خروج المغلوب claudin-7.

ثقافة ثلاثية الأبعاد لخبايا القولون الفئران لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية المعوية خارج الجسم الحي

هنا ، وصفنا بروتوكولا لثقافة الخنازير المعوية 3D organoids من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد. نحن أيضا وصف طريقة لإنشاء أحادي الخلية المستمدة من المواد العضوية 3D ، مما يسمح بالوصول إلى الجانب القمي للخلايا الظهارية.

ثقافة الخنازير المعوية 3D العضوية من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد وإنشاء أحاديات الخلية

وصفنا بروتوكولا لعزل خبايا الفئران المعوية الصغيرة والثقافة العضوية المعوية 3D من الخبايا. بالإضافة إلى ذلك ، وصفنا طريقة لتوليد المواد العضوية من خلية جذعية معوية واحدة في حالة عدم وجود مكانة خلوية شبه ظهارية.

زراعة 3D من المواد العضوية من خبايا الفئران المعوية وخلية جذعية واحدة للبحوث العضوية

يوفر هذا البروتوكول دليلا تفصيليا لشراء بنكرياس الخنازير لعزل الجزر...

التروية الجراحية وعزل البنكرياس الخنازير لعزل الجزر

تحدد هذه الدراسة بروتوكولا لتوليد طبقات أحادية ثنائية الأبعاد من عضيات الخنازير المشتقة من الأمعاء الدقيقة والغليظة. يتميز نمو هذه الطبقات الأحادية بزيادة قيم TEER ، مما يشير إلى سلامة ظهارية قوية. بالإضافة إلى ذلك, هذه أحادية الطبقات يعرض الاستجابات الإفرازية الفسيولوجية في تجارب غرفة أوسينج بعد تطبيق فورسكولين.

عضيات معوية خنزير ثنائية الأبعاد تعكس الخصائص الفسيولوجية للأمعاء الأصلية

تعلم عزل الخلايا الجذعية المعوية وثقافتها في نموذج الخنزير من المجزأ الاسكيمية الأمعاء الصغيرة. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة آليات إصلاح النسيج الظهاري بعد الإصابات الإقفارية.

عزل الخلايا الجذعية المعوية والثقافة في نموذج الخنزير من المجزأ الاسكيمية الأمعاء الصغيرة

استكشف المزيد من الفيديوهات