عزل الخلايا الجذعية المعوية والثقافة في نموذج الخنزير من المجزأ الاسكيمية الأمعاء الصغيرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم آثار نقص التروية المعوية على الخلايا الجذعية الظهارية المعوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية ، مثل كيفية مقاومة الخلايا الجذعية للإصابة والمساهمة في الإصلاح بعد الإصابة الإقفارية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها نموذج حيواني كبير يمكن استخدامه لدراسة أمراض الأمعاء السريرية وإصلاحها.

ستظهر الإجراء إيمي ستيلر ستيوارت ، طالبة دراسات عليا ، وجون فرويند ، أخصائي أبحاث من مختبري. ابدأ باستخدام شفرة مشرط لعمل شق بطني في خط الوسط من ثمانية إلى 10 سنتيمترات على البطن متمركزا في سرة خنزير يوركشاير مهجن يبلغ من العمر ثمانية إلى 10 أسابيع. حدد موقع الصائم ، حوالي 40 سم عن طريق الفم إلى التقاطع اللفائفي.

اربط الأمعاء بشكل محيطي مرتين لتحديد حلقات الصائم بطول 10 سنتيمترات مع سنتيمتر واحد بين كل رباط قم بإنشاء حلقتين لكل نقطة زمنية من نقص التروية متجاورة لبعضهما البعض ، واحدة للإقفار والأخرى للإقفار مع ساعة إضافية من إعادة التروية. للحث على نقص تروية كاملة قابلة للانعكاس ، استخدم مشابك الأوعية الدموية البلدغية أو المرقئ لعرقلة ما يقرب من ثلاث أوعية مساريقية لكل مشبك للفترة الزمنية التجريبية المناسبة.

حافظ على تغطية البطن طوال فترة الإقفار. في نهاية التجربة ، استخدم مقص Metzenbaum أولا لجمع قطعة تحكم من الصائم العادي على الأقل من خمسة إلى 10 سنتيمترات قريبة من آخر حلقة إقفارية ، متبوعة بجمع بقية الحلقات. قم بتخزين الحلقات من كل نقطة زمنية للإصابة في حاويات صغيرة من PBS المثلج حتى عزل القبوة.

لعزل الخلايا الجذعية للسرداب ، استخدم سلكا عيار 20 ملقطا للأنسجة لقلب كل حلقة من الأمعاء الدقيقة بحيث يتعرض سطح الغشاء المخاطي. قم بخياطة الجزء العلوي والسفلي من كل حلقة بإحكام على السلك ، واشطف كل حلقة مقلوبة في PBS مثلج. عندما تتم إزالة كل الحطام اللمعي ، ضع العينات على الفور في أنابيب مخروطية فردية سعة 50 مليلتر تحتوي على 30 مل من كاشف التفكك رقم واحد على الجليد لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز والانعكاس كل خمس دقائق.

في نهاية فترة الحضانة ، قم بنقل العينات إلى أنابيب 50 مليلتر مقابلة تحتوي على 30 مل من كاشف التفكك رقم اثنين وحبيبات عينات الحلقة الإقفارية من ساعتين إلى أربع ساعات عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الكريات في خمسة ملليلتر من PBS واستخدم 50 ميكرولتر من كل عينة للتحقق من درجة ارتباط القبو وكمية الحطام بواسطة المجهر الضوئي. بعد ذلك ، ضع العينات في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع الاهتزاز أو الانعكاس كل خمس دقائق.

ثم انقل العينات مباشرة إلى 25 مل من PBS المثلج البارد على الجليد في شاكر مداري مضبوطة على 60 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق من الاهتزاز مع اهتزاز يدوي إضافي أو انعكاس كل 30 ثانية. في نهاية حضانة الاهتزاز ، تحقق من درجة ارتباط القبو وكمية الحطام وانقل العينات إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 مليلتر تحتوي على 25 مل من PBS البارد للاهتزاز حتى يتم عزل الخبايا السليمة بأقل قدر من الحطام والزغابات. عندما يتم فصل الحلقات تماما ، قم بإزالة الأنسجة المتبقية ، وحبيبات العينات عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق كريات القبو المتبقية في خمسة ملليلتر من PBS الطازج.

ثم قم بنقل 150 سردابا لكل أنبوب في أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية وحبيبات الخبايا عن طريق الطرد المركزي الدقيق. باستخدام ماصة مبردة مسبقا، أعد تعليق الكريات برفق باستخدام 50 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل بئر متبوعا بسحب سريع 15 مرة للخلط. بعد ذلك ، قم بتوزيع قطرة سرداب سعة 50 ميكرولتر في وسط كل بئر من صفيحة 24 بئر مسبقة الديدان وشبكية وضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية.

بعد 30 دقيقة ، قم بتراكب كل فطيرة مصفوفة ب 500 ميكرولتر لكل بئر من وسط الخلايا الجذعية الظهارية المعوية مع إضافة 500 ميكرولتر من PBS المعقم إلى أي آبار غير مستخدمة للحفاظ على الرطوبة وحساب عدد الخبايا المطلية باليوم الصفر. أضف عوامل النمو إلى كل بئر كل 48 ساعة ، واستبدل المادة الطافية كل 96 ساعة ب 500 ميكرولتر من الوسط الطازج المكمل بعامل النمو. يتم إنشاء نقص تروية الأمعاء الكامل في حلقات معوية دقيقة من خلال استخدام انسداد الأوعية الدموية بالخيوط أو المشابك ، كما هو موضح.

إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، فستبدأ الإصابة الإقفارية عند طرف الزغابات المعوية وتهاجر داخل القبو مع زيادة مدة نقص التروية. يمكن أن يحدث أحد الأخطاء الشائعة في التقنية الجراحية عندما تكون الأوعية الدموية غير مربوطة أو مثبتة بالتساوي ، مما يؤدي إلى نقص تروية نزفي ينهار فيه الوريد ذو الجدران الرقيقة قبل الشريان ، مما يسمح لدم إضافي بالتسلل إلى الأنسجة. بعد إزالة الحلقات المعوية الإقفارية ، يمكن عزل الخبايا المعوية بنجاح باتباع بروتوكول التفكك كما هو موضح للتو.

غالبا ما يتم كسر الخبايا من النقاط الزمنية الأكثر تضررا وتحتوي على المزيد من الحطام الخلوي الخلوي مقارنة بتلك التي لا تتعرض لأي ضرر أو طفيف. عندما يتم طلاء الخبايا المعوية الطبيعية والتالفة بشكل طفيف في الثقافة ، تتشكل الأمعاء في غضون 24 إلى 48 ساعة. مع التلف الإقفاري الشديد ، تبقى الخبايا المعوية على قيد الحياة ولكنها تتلف مما يؤدي إلى تكوين كرات أصغر بكثير في البداية.

بحلول 72 إلى 120 ساعة ، تصبح الأمعاء المعوية من جميع الخبايا أكثر تعقيدا مع التجويف المركزي الواضح والهياكل الناشئة ، ومع انخفاض كفاءة نمو القبو بشكل عام ، بالإضافة إلى انخفاض الحجم في الأمعاء المشتقة من أنسجة الأمعاء المتضررة بشدة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال إجراءات طلاء عزل القبو في حوالي ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. من الأفضل أن تكون الخبايا التي تم جمعها للطلاء مشتقة من الغسالات وليس من كسور الانفصال بسبب زيادة احتمالية تلوث الثقافة في جزء الانفصال.

يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لاختبار فعالية الأدوية لعلاج الإصابات الظهارية الناتجة عن نقص التروية زائد أو ناقص إعادة التروية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الجهاز الهضمي لاستكشاف تأثير نقص التروية على الظهارة على وجه التحديد على الخلايا الجذعية المعوية في نموذج حيواني كبير متعددي ذي صلة سريريا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نقص تروية معوي مع أو بدون إعادة التروية وكذلك لعزل الخبايا المعوية لثقافة ثلاثية الأبعاد بعد الإصابة في الجسم الحي.