التحديد الكمي مورفولوجية Microglia من Photomicrographs Immunohistochemistry استعداد النسيج باستخدام إيماجيج

الهدف العام من طرق تحليل الهيكل العظمي والكسورية هو قياس مورفولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة المحضرة من IHC ، باستخدام طرق كمية عالية الإنتاجية بطبيعتها وحساسة للكشف عن الاختلافات الصغيرة في أشكال الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الالتهابات العصبية ، من خلال تحديد الفروق الدقيقة في شكل الخلايا الدبقية الصغيرة ووظيفتها أثناء الصحة والمرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تحدد مورفولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام المتغيرات المستمرة بدلا من المتغيرات الفئوية.

لا تتطلب الطرق الموضحة هنا برامج احتكارية ، ويمكن استخدامها لفحص مناطق الدماغ أو تحليل كل خلية تلو الأخرى. ستظهر الإجراء كيمبرلي يونغ ، فنية من مختبري. قبل البدء ، تأكد من تنزيل المكون الإضافي AnalayzeSkeleton إلى ImageJ أو Fiji.

ثم افتح كومة Z بحجم 30 ميكرون تظهر دماغا منيعيا Iba1. إذا كنت تستخدم صورة مجهرية مضان ، فتأكد من أن الصورة 8 بت ، وقم بالتحويل إلى مقياس رمادي لتصور جميع التلوين الإيجابي بشكل أفضل. استخدم شريط الأدوات وانقر فوق صورة ، جداول البحث ، رمادي.

إذا كنت تستخدم صورة المجال الساطع DAB ، فاستخدم أولا المكون الإضافي لمرشح FFT Bandpass مع الإعدادات الافتراضية. انقر فوق عملية ، FFT ، مرشح ممر النطاق ، ثم قم بالتحويل إلى مقياس رمادي. إذا كانت الصورة باهتة جدا بحيث لا يمكن تصور عملية الخلايا الدبقية الصغيرة ، فاستخدم شريط الأدوات وانقر فوق الصورة ، ضبط ، السطوع / التباين.

اضبط أشرطة التمرير الدنيا أو القصوى حسب الحاجة، حتى حواف الرسم البياني ولكن ليس أكثر. ينتج عن ضبط السطوع أكبر قدر من التباين في تحليل البيانات ، وبالتالي فهو الخطوة الأكثر أهمية. بعد ذلك ، قم بتشغيل مرشح Unsharp Mask لزيادة التباين ، بالنقر فوق معالجة ، عوامل تصفية ، Unsharp Mask.

قم بتنفيذ خطوة إزالة البقع لإزالة ضوضاء الملح والفلفل الناتجة عن قناع Unsharp. استخدم شريط الأدوات وانقر فوق معالجة ، ضوضاء ، إزالة البقع قم بتحويل الصورة إلى ثنائية عن طريق تحديد الصورة ، ضبط ، الحد.

ثم قم بتطبيق وظيفة Despeckle على الصورة الثنائية لإزالة أي ضوضاء بكسل واحدة متبقية. ثم قم بتطبيق وظيفة الإغلاق بالنقر فوق معالجة ، ثنائي ، إغلاق ، لتوصيل وحدات البكسل الداكنة مفصولة بحد أقصى بكسلين. بعد ذلك ، قم بإزالة القيم المتطرفة بالنقر فوق معالجة ، ضوضاء ، إزالة القيم المتطرفة.

بعد حفظ الصورة كملف منفصل لاستخدامها في المستقبل ، قم بهيكل الصورة باستخدام شريط الأدوات ، بالنقر فوق عملية ، ثنائي ، هيكل عظمي. حدد الصورة المهيكلة وقم بتشغيل المكون الإضافي AnalyzeSkeleton بالنقر فوق الإضافات والهيكل العظمي وتحليل الهيكل العظمي وتحديد مربع معلومات الفرع. انسخ البيانات من نتائج ومخرجات معلومات الفرع، والصق البيانات في جدول بيانات Excel.

في Excel، قم بقص البيانات لإزالة أجزاء الهيكل العظمي الناتجة عن IHC والحصول على الصور. حدد طول الأجزاء التي سيتم اقتطاعها من مجموعة البيانات عن طريق فتح الصورة الهيكلية في ImageJ وتحديد أداة الخط. قم بقياس عدة أجزاء ، مع ملاحظة متوسط الطول ، وتحديد قيمة القطع ، والتي يجب أن تكون متسقة في جميع أنحاء مجموعة البيانات.

قم بفرز جدول بيانات Excel بالنقر فوق فرز وتصفية، فرز مخصص. قم بالفرز حسب فوكسل نقطة النهاية من الأكبر إلى الأصغر ، وفي مستوى جديد ، حسب فرع Mx PT من الأكبر إلى الأصغر. قم بإزالة كل صف يحتوي على نقطتي نهاية بحد أقصى لطول الفرع أقل من قيمة القطع.

جمع البيانات في عمود نقاط النهاية لحساب العدد الإجمالي لنقاط النهاية التي تم جمعها من الصورة. كرر لبيانات معلومات الفرع بعد الفرز حسب طول الفرع. بعد اقتطاع جميع البيانات وتلخيصها ، قسم البيانات من كل صورة على عدد الخلايا الدبقية الصغيرة في الصورة المقابلة.

أدخل نقطة النهاية النهائية وطول الخلية والفرع لكل بيانات خلية في البرنامج الإحصائي. تأكد من تنزيل المكون الإضافي FracLac. ثم استخدم أداة المستطيل لرسم عائد الاستثمار.

تأكد من أن المربع كبير بما يكفي لالتقاط الخلية بأكملها، ويمكن أن يظل متسقا طوال مجموعة البيانات. في نافذة مدير العائد على الاستثمار، حدد تحديث لتأمين عائد الاستثمار على خلية محددة عشوائيا في الصورة المجهرية. افتح الصورة الثنائية التي تحتوي على الخلية المحددة.

انقر نقرا مزدوجا فوق أداة Paintbrush، واضبط اللون على الأسود، واضبط عرض الفرشاة حسب الحاجة. باستخدام الصورة المجهرية المطابقة كمرجع ، استخدم فرشاة الرسم لإزالة عمليات الخلايا المجاورة ، وتوصيل العمليات المجزأة ، وعزل الخلية ذات الاهتمام. بمجرد عزل الخلية الثنائية، احفظ الملف الثنائي.

قم بتحويل الخلية الثنائية إلى مخطط تفصيلي باستخدام شريط الأدوات، عبر العملية والثنائي والمخطط التفصيلي. في شريط الأدوات ، افتح FracLac باستخدام شريط الأدوات ، بالنقر فوق المكونات الإضافية ، وتحليل الكسورية ، و FracLac ، وحدد BC لعد الصناديق. في تصميم الشبكة ، قم بتعيين Num G إلى أربعة.

ضمن خيارات الرسومات ، حدد مربع المقاييس لتحليل الهيكل المحدب والدائرة المحيطة للخلية. عند الانتهاء، حدد موافق ثم حدد الزر Scan لتشغيل فحص عد المربع على الصورة المحددة. في نافذة نتائج الهيكل والدائرة، انسخ جميع نتائج البيانات المطلوبة.

ثم افعل الشيء نفسه في نافذة ملخص عدد الصناديق. نقل البيانات المنسوخة إلى ملف Excel أو برنامج إحصائي. يوضح هذا الرسم البياني بيانات موجزة لنقاط نهاية الخلايا الدبقية الصغيرة لكل خلية والطول المعالج لكل خلية في الأنسجة القشرية غير المصابة والمصابة.

هذه هي نتيجة التحليل مع تطبيق البروتوكول. في كلتا الحالتين ، تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار الطلاب T ، وتم تحليل ثلاث صور. يجب توخي الحذر فيما يتعلق بالتباين بين المستخدمين في تطبيق البروتوكول.

يتم تلخيص هذه الاختلافات هنا ، حيث تم تحليل نفس مجموعة البيانات من قبل مستخدمين مستقلين يطبقان بروتوكولا متطابقا. على الرغم من أن الاتجاهات متشابهة طوال الوقت ، إلا أن التباين بين المستخدمين يؤثر على أهمية البيانات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الهدف هو الحصول على هيكل عظمي أو نموذج مخطط تفصيلي يمثل الصورة المجهرية الأصلية.

هذا يعني أن الخطوات قد تكون قابلة للتعديل وفقا للاحتياجات المحددة للمحقق. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد مورفولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة بسرعة من الصور المجهرية لأنسجة الكيمياء المناعية باستخدام برامج الكمبيوتر المتاحة بسهولة.