وصف عمليات إصلاح الحمض النووي في فواصل الحمض النووي عابرة وطويلة الأمد مزدوجة-حبلا مجهر الفلورة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إصلاح الحمض النووي مثل كيفية تنظيم تكوين معقد إصلاح الحمض النووي وتوطينه وحلها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تكتشف بشكل لا لبس فيه التغييرات وإصلاح التوطين والحركية المعقدة. بالإضافة إلى هؤلاء الباحثين الجامعيين في مختبري ، سيقوم ثلاثة طلاب دراسات عليا بإجراء التجارب.

سيكون ذلك تشانغكون هو ودالتون داكوس وستيفن والترهاوس. للبدء ، قم بزراعة خلايا U2OS / DR-GFP على صفيحة زراعة الأنسجة بطول 10 سم حتى تصبح 85 إلى 90٪ ملتقية. ثم قم بإزالة الوسط ، وأضف ثلاثة ملليلتر من EDTA ، واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق.

استبدل EDTA بملليلتر واحد من التربسين واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم أضف خمسة ملليلتر من DMEM لتحييد التربسين. بعد عد الخلايا ، قم بالبذور ستة في 10 إلى الخلايا الثالثة لكل بئر في 200 ميكرولتر من الوسط في صفيحة زجاجية ذات 96 بئر.

بدلا من ذلك ، قم بالبذور أربعة في 10 إلى ستة آبار في ثمانية ملليلتر من المتوسط على زلات غطاء 12 ملم موضوعة في صفيحة 10 سم ، ثم تنمو الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. للحث على فواصل الخيوط المزدوجة ، أو DSBs ، استبدل الوسط ببيروكسيد الهيدروجين المخفف بتركيز 25 ميكرومولار مع DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS واحتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x PBS ، ثم أضف DMEM الطازج.

لإصلاح الخلايا بعد احتضانها ، استخدم PBS لغسل اللوحة ثلاث مرات. ثم استخدم إبرة وملقط لإزالة زلة الغطاء بعناية من اللوحة التي يبلغ طولها 10 سم لكل نقطة زمنية ووضعها في بئر واحد من صفيحة 24 بئرا. أضف 4٪ PFA واحتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة.

ثم نحن PBS لغسل زلات الغطاء ثلاث مرات. لاختراق الخلايا ، أضف 0.5٪ منظف غير أيوني و PBS. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

ثم اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام PBS ثلاث مرات. بعد ذلك ، أضف 3٪ BSA و 0.1٪ منظف غير أيوني مخفف في PBS إلى زلقات الغطاء في صفيحة 24 بئرا واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم أضف الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف بروتين الإصلاح محل الاهتمام وتحتضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد غسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات ، أضف DAPI واحتضن الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم احتضان العينات بالأجسام المضادة الثانوية. بعد غسل الخلايا كما كان من قبل ، استخدم كاشف التثبيت لتركيب جانب الخلية المنزلق للغطاء لأسفل على الشرائح.

اضغط بعناية على زلات الغطاء واستخدم منديلا لامتصاص أي كاشف تثبيت زائد. أغلق زلات الغطاء بطلاء أظافر شفاف سريع الجفاف وتأكد من إحكام إغلاق كامل لانزلاق الغطاء مع الشريحة. التقط صورا مجهرية متحدة البؤر من خلال التركيز على قناة DAPI.

لتحديد النوى في صور التألق المناعي ، افتح الصور متحد البؤر عن طريق سحب ملف الصورة إلى نافذة ImageJ أو عن طريق تحديد مستورد التنسيقات الحيوية من شريط أدوات المكون الإضافي في ImageJ. ثم حدد تقسيم القنوات. ضمن خيارات الألوان ، حدد ملون من القائمة المنسدلة.

حدد موافق لفتح صور DAPI و histone H2AX كنوافذ منفصلة واختر صورة DAPI. ثم حدد شريط أدوات الصورة في خيار ضبط العتبة لتحديد النوى. بعد ذلك ، اضبط عتبة الصورة عن طريق تحريك الشريط السفلي لنافذة العتبة بالكامل إلى اليمين.

اضبط الشريط العلوي حتى تظهر النوى باللون الأحمر تماما مع مخططات مميزة وتصبح الخلفية سوداء. ثم حدد شريط أدوات التحليل وخيار تحليل الجسيمات. أدخل الحد الأدنى لحجم النواة.

من القائمة المنسدلة العرض، حدد المخططات التفصيلية، ثم حدد خيار إضافة إلى المدير. انقر فوق موافق لفتح نافذة مدير عائد الاستثمار. من نافذة مدير عائد الاستثمار، قم بتعيين أرقام للنوى عن طريق التحديد.

لاستخدام ImageJ لتحديد بؤر H2AX وصور الفحص المجهري المناعي ، حدد نافذة بؤر H2AX. ثم حدد شريط أدوات العملية واختر البحث عن الحد الأقصى للعثور على البؤر داخل النوى. من القائمة المنسدلة لنوع الإخراج ، اختر خيار النقاط المفردة وحدد تحديد نقطة المعاينة لتصور البؤر القصوى.

ثم أدخل قيمة تحمل الضوضاء اعتمادا على شدة الإزهار للصورة. من نافذة مدير عائد الاستثمار ، حدد النوى التي يجب تحديد بؤر H2AX لها. حدد القياس لقياس عدد البؤر القصوى داخل النوى المحددة.

انسخ قيم الكثافة الأولية والصقها في برنامج لتحليل البيانات. بعد الجلوس في الخلايا على ألواح 96 بئرا مع زلات غطاء كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو ، قم بتحفيز فواصل الخيوط المزدوجة باستخدام عامل transfectionary قائم على الدهون لنقل الخلايا باستخدام متجه تعبير I-SceI. للحصول على تخيل بعد غسل خلايا نفاذية ومسدودة كما هو موضح سابقا ، أضف أجساما مضادة ضد جاما H2AX وإصلاح البروتين ذي الأهمية.

مع 1x PBS ، ينزلق غطاء اللوحة المكون من 96 بئرا ثلاث مرات. ثم احتضان زلات غطاء اللوحة المكونة من 96 بئرا بالأجسام المضادة الثانوية. أخيرا ، بعد تحديد الخلايا التي تحتوي على تركيز كبير على جاما نووية H2AX ، احسب يدويا تلك التي تظهر أيضا ترابطا مع بروتين الإصلاح ذي الأهمية.

يوضح هذا الشكل تمييزا في الضوضاء قدره 90 ويشير إلى العدد الصحيح للبؤر. لا يتم حساب النوى الموجودة على الحافة والبؤر خارج النوى أثناء القياس الكمي. تصور اللوحة الموضحة هنا تحملا منخفضا للضوضاء يبلغ 50.

يتم تحديد العديد من القصوى خارج النواة وداخل النواة. تم العثور على تحمل عالي للضوضاء يبلغ 220 في هذه الخلية. تم الكشف عن بؤرة واحدة فقط.

تصوير التموضع المشترك لتركيز جاما H2AX وبروتين الإصلاح ذي الأهمية في هذا الشكل. تظهر هنا خلية غير منقولة ، وتظهر خلية ذات تركيز جاما H2AX غير نووي في الجزء العلوي الأيمن. عند التكبير العالي ، يمكن تمييز صورة أوضح للتركيز الداخلي الحقيقي والتركيز غير النووي أو الخارجي.

أخيرا ، يظهر هنا مثال على تركيز جاما نووية H2AX دون تحديد موقع بروتين الإصلاح. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أيام قليلة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل ترسيب المتحورات المشتركة من أجل تحديد التفاعلات بين بروتينات الإصلاح ذات الأهمية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة تكوين وحل مجمعات إصلاح الحمض النووي عن طريق إحداث فواصل مزدوجة عابرة في الحمض النووي. سوف تتعلم أيضا كيفية التمييز بشكل لا لبس فيه بين التوطين الخاطئ لعوامل الإصلاح والتأخير في التوظيف عن طريق إحداث آفات طويلة الأمد.