أسلوب إعداد نموذج فعال لتعزيز الإشارات أيون الكربوهيدرات في مصفوفة-بمساعدة الليزر الامتزاز/التأين الكتلي

ويتجلى بروتوكولا لتعزيز الإشارات أيون الكربوهيدرات في استخدام الطيف الكتلي بإصلاح الهياكل البلورية أثناء عمليات إعداد عينة.

تم تطوير إجراء بسيط لإعداد العينة لتحسين الطريقة التقليدية في قياس الطيف الكتلي للتأين بالليزر بمساعدة المصفوفة عن طريق إصلاح التشكل البسيط أثناء عملية التجفيف. تتمثل ميزة هذه التقنية في أنه يمكن تحسين شدة إشارة عينات الكربوهيدرات المحضرة بهذه الطريقة المحسنة بشكل فعال. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن خطوة إزالة ضغط الميثانول أمر بالغ الأهمية ويجب القيام بها دفعة واحدة.

أي تردد سيقلل من جودة البيانات. للبدء ، أثناء ارتداء قفازات النتريل ، استخدم 100 مل من محلول المنظفات لغسل لوحة العينة يدويا. استخدم الماء المقطر منزوع الأيونات أو DD لغسل الطبق يدويا.

ثم ، مع 30 مل من الميثانول ، اشطف سطحه. أدخل لوحة العينة في دورق سعة 600 مل واملأها بماء DD حتى يتم غمر اللوحة بالكامل. ثم ضع الدورق في حمام بالموجات فوق الصوتية وصوتنة اللوحة لمدة 15 دقيقة.

قم بإزالة لوحة العينة من الدورق واستخدم النيتروجين المضغوط لتفجير قطرات الماء. ثم قم بإيداع 0.2 ميكرولتر من الميثانول على لوحة العينة للتحقق مما إذا كان ينتشر إلى أماكن أخرى. إذا حدث ذلك ، كرر الغسيل والصوتنة ومعالجة النيتروجين كما هو موضح للتو.

بعد تحضير غرفة التجفيف وفقا لبروتوكول النص ، قم بخلط 0.25 ميكرولتر من محلول حمض 2 و 5-Dihydroxybenzoic و 0.25 ميكرولتر من Sialyl-Lewis A ، أو محلول مالتوهبتاز في أنبوب الطرد المركزي الصغير. ثم قم بدوامة الأنبوب لمدة ثلاث ثوان. قم بتدوير المحلول المختلط في جهاز الطرد المركزي الصغير بمعدل 2000 ضعف G لمدة ثانيتين.

ثم قم على الفور بوضع 0.1 ميكرولتر من المحلول المخلوط مسبقا على لوحة العينة. عندما تجف العينة ، أثناء العمل بسرعة لتجنب التبخر ، قم بوضع ماصة 0.2 ميكرولتر من الميثانول مباشرة على بقعة العينة. سوف تذوب العينة ثم تجف على الفور.

خطوة ترسيب الميثانول هي أصعب خطوة تحدد جودة البيانات وقابليتها للتكرار. لضمان أفضل أداء ، نوصي المستخدم بإنهاء الترسيب في ثلاث إلى خمس ثوان لتجنب فقدان كبير للتبخر للميثانول. ارتد قفازات النتريل وقم بإزالة لوحة العينة بعناية من غرفة التجفيف.

ثم ، تحت المجهر ، افحص العينة. إذا لم تكن الأشكال البلورية كما هو متوقع ، كرر خلط العينة واكتشاف لوحة العينة. للتأكد من أن بلورات العينة لديها التشكل الأمثل بعد إعادة التبلور ، استخدم دائما مجهرا لفحصها.

من الصعب تحديد جودة مورفولوجيا البلورات بشكل صحيح بالعين المجردة. لتحليل عينة ميكرولتر واحد ، قم بخلط 2.5 ميكرولتر من محلول حمض 2 و 5-ثنائي هيدروكسي بنزويك و 2.5 ميكرولتر من محلول Sialyl-Lewis A أو محلول مالتكافئ في أنبوب طرد مركزي صغير. دوامة المحلول المختلط مسبقا لمدة خمس ثوان.

قم بتدوير المحلول المختلط عند 2000 مرة G لمدة ثانيتين ، ثم قم على الفور بسحب ميكرولتر واحد من المحلول المخلوط مسبقا على لوحة العينة. بعد أن تجف العينة ، قم بوضع 1.5 ميكرولتر من الميثانول مباشرة على بقعة العينة المجففة. سوف تذوب العينة وتجف على الفور.

قم بإزالة العينة بعناية من غرفة التجفيف. افحص العينة تحت المجهر. إذا لم تكن الأشكال البلورية كما هو متوقع ، كرر تحضير المحلول كما هو موضح للتو.

لإجراء قياس الطيف الكتلي ، افتح برنامج التحكم في مطياف الكتلة وأدخل لوحة العينة في الجهاز. حدد طريقة الحصول على البيانات المحسنة مسبقا في البرنامج ، ثم باستخدام برنامج التصوير ، قم بتسجيل منطقة العينة بأكملها لقياس الطيف الكتلي للتصوير. ابدأ الحصول على البيانات في وضع الدفعات لبرنامج التحكم.

عند اكتمال الحصول على البيانات ، استخدم برنامج التصوير لرسم الصور الأيونية وتحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص. تظهر هنا صور SEM التمثيلية ل Sialyl-Lewis A ممزوجة بحمض 2 ، 5-Dihydroxybenzoic المحضرة باستخدام طرق القطرات المجففة وإعادة التبلور. مورفولوجيا حمض ثنائي هيدروكسي بنزويك النموذجية 2 ، 5 هي بلورات كبيرة على شكل إبرة عند الحافة وهياكل بلورية دقيقة في وسط بقع العينة.

بعد إعادة التبلور بواسطة الميثانول ، تحتوي العينة على مساحة أكبر مغطاة بالتساوي ببلورات دقيقة تشبه التقشر. يصور هذا الشكل نتائج قياس الطيف الكتلي للتصوير ل Sialyl-Lewis A و maltoheptaose مع وبدون إعادة بلورة الميثانول. بعد إعادة التبلور ، يتطابق توزيع إشارات Sialyl-Lewis A و maltohepaose بشكل جيد مع صور المجال الساطع لبقع العينة.

كما يتم تحسين شدة الإشارة لعينات الكربوهيدرات المعاد تبلورها مقارنة بعينات القطرات الجافة التقليدية. يقارن هذا الرسم البياني شدة إشارة الوضع الأيوني الموحل أو الموبا والكربوهيدرات في الوضع الأيوني منزوع البروتون أو السالبة للعينات المعاد تبلورها فيما يتعلق بعينات القطرات المجففة. في المتوسط ، أدت إعادة بلورة عينات Sialyl-Lewis A و maltoheptaose إلى زيادة الإشارات الصودية بعاملين 3.9 و 3.3.

تم تعزيز إشارات أيون Sialyl-Lewis A منزوعة البروتون بمعامل 4.7 بعد إعادة التبلور. بمجرد إتقانها ، يمكن تحضير العينات في غضون 10 دقائق باستخدام هذه التقنية إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن يتم ترسيب قطرة الميثانول على الفور وبدقة في بقعة العينة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحكم الفعال في مورفولوجيا البلورات للعينات المتعددة للحصول على أفضل الإشارات الأيونية للتحليل الروتيني.