تصنيع نانوباتيرن التدرج الحراري نانويمبرينتينج تقنية والفحص لاستجابة الخلايا البشرية تشكيل مستعمرة غشائي

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تنتج أنماطا متدرجة ذات قابلية عالية للتكاثر وتسمح بفحص استجابة الخلية لهياكل مراقبة الطفيليات. لم يتم اكتشاف الاستجابة التي يلاحظها التحفيز البدني بالكامل بعد. نعتقد أن طريقتنا ستكون أداة أساسية للكشف عن هذه الآليات غير المعروفة.

للبدء ، قم بتوصيل دورق سترة مزدوج يحتوي على محلول التلميع الكهربائي بجهاز دائري واضبط درجة الحرارة على سبع درجات مئوية. اترك المحلول تحت التحريك لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى تنخفض درجة الحرارة إلى سبع درجات مئوية. اغمر صفيحة الألمنيوم فائقة النقاء والقطب المضاد للكربون في محلول التلميع الكهربائي باستخدام مشابك التمساح والأسلاك النحاسية.

اضبط موضع صفيحة الألمنيوم في قطب عداد الكربون لمواجهة بعضها البعض. قم بتوصيل لوحة الألمنيوم بالطرف الموجب وقم بتوصيل قطب عداد الكربون بالطرف السالب لمصدر طاقة التيار المباشر. بعد تطبيق جهد 20 فولت ، تنتقل صفيحة الألمنيوم من وجود سطح خشن خال من اللمعان إلى لون فضي يشبه المرآة.

لإجراء الأنودة الأولية ، اسكب لترا واحدا من المنحل بالكهرباء في دورق سترة مزدوجة سعة لترين. غمر صفيحة الألمنيوم المصقولة والقطب الكهربائي المضاد للكربون في المحلول بمشابك التمساح في الأسلاك النحاسية. قم بتثبيت عمود عمودي على قاعدة على شكل حرف U.

قم بتوصيل محرك علوي ومكره باستخدام مشابك معدنية. ضع مروحة المكره بالقرب من الطرف السفلي لكلا القطبين. اضبط سرعة دوران التحريك العلوي بين 200 و 300 دورة في الدقيقة وقم بتطبيق جهد 195 فولت تحت التحريك لمدة 16 ساعة.

بعد الأنودة الأولية ، يتغير لون صفيحة الألمنيوم من الفضة إلى الرمادي. لأداء حكة الألومينا ، اغمر صفيحة الألمنيوم المؤكسد في محلول الحفر. أغلق الجزء العلوي من الدورق بورق الألمنيوم واتركه يقلب لمدة 10 ساعات على الأقل.

أثناء خطوة النقش ، يتغير لون صفيحة الألمنيوم من الرمادي إلى الأبيض. بالنسبة لأكسيد الألومنيوم الثانوي ، قم بإعداد نفس الظروف التجريبية مثل الأنودة الأولية وقم بتطبيق جهد 195 فولت مرة أخرى لمدة ست ساعات. بعد الأنودة الثانوية ، يتغير لون صفيحة الألمنيوم من الأبيض إلى الرمادي.

لإجراء توسيع المسام المتدرجة ، قم أولا بتوصيل دورق الغلاف المزدوج الذي يحتوي على محلول حمض الفوسفوريك بالدائري واضبط درجة الحرارة على 30 درجة مئوية. ضع مرحلة متحركة خطية عموديا بجوار الدورق وقم بإرفاق قوس بالجزء المتحرك من المرحلة الخطية. اضبط الجزء المتحرك من المرحلة الخطية على موضع المنزل.

قم بتوصيل مشبك الحامل وقم بتحميل لوحة الألمنيوم المؤكسدة. قم بمعالجة موضع لوحة الألمنيوم يدويا بحيث تأتي لوحة الألمنيوم فوق سطح المحلول مباشرة. اغمر صفيحة الألمنيوم تدريجيا في المحلول بسرعة أربعة نقاط وثمانية ستة ميكرون في الثانية لمدة 120 دقيقة لعمل قالب AAO مقاس 35 ملم بتدرج حجم من 120 نانومتر إلى 200 نانومتر.

ابدأ ساعة الإيقاف في اللحظة التي تلامس فيها لوحة الألومنيوم سطح المحلول. بعد مرور 100 دقيقة ، يجب أن يكون نصف قالب AAO في المحلول. لصنع قوالب GP 200 إلى 280 و GP 280 إلى 360 ، غمر كامل مساحة قالب GP 120 إلى 200 في محلول توسيع المسام لمدة ساعتين إلى أربع ساعات على التوالي.

اغمر قالب AAO ومحلول سمكة البيرانا لمدة 30 ثانية باستخدام ملقط غير معدني. اشطف قالب AAO عدة مرات بالماء منزوع الأيونات. انقع القالب في ماء منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة وضع في كحول الميثيل لمدة 30 دقيقة أخرى.

جفف قالب AAO تماما تحت الفراغ لمدة ثلاث ساعات. لترسيب الطبقات الأحادية ذاتية التجميع ، اغمر قالب AAO في 57 مل من المرشح والهكسان ودورق 100 ملليلتر. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من محلول مخزون HDFS إلى N hexane لعمل محلول HDFS 2.9 ملليمولار وانتظر 10 دقائق حتى يستمر التفاعل.

بعد نقل قالب AAO إلى طازج وهكسان ، نقع قالب AAO في 60 مل من الميثوكسي - نونافلوروبوتان. قم بتنظيف قالب AAO بالموجات فوق الصوتية في دورق لمدة 10 ثوان في مرة واحدة لإزالة جزيئات HDFS الممتصة جسديا. كرر إجراء التنظيف 10 مرات قبل تجفيف قالب AAO تحت الفراغ لمدة 24 ساعة.

قم بقص لوح بوليسترين بسمك نقطة واحدة بسمك ملليمتر واحد بحجم نقطتين تسعة ملليمترات بعرض ثلاثة نقاط وسبع ملليمترات باستخدام قاطع لوحة الدوائر المطبوعة. العمل في غرفة نظيفة ، قم بقص قالب AAO 35 ملم من الأسفل باستخدام القراص. ضع علامة على اسم العينة والشركة المصنعة للبيانات على الظهر.

نظف رقاقة بهشتي نقاط صفر بوصة بجرعة صغيرة من الكحول الإيثيلي ، ثم ضع صفائح البوليسترين على الرقاقة وقم بتركيب قالب AAO. بعد ذلك ، ضع الفيلم السفلي في درج الطابعة الحرارية وقم بتوصيل الفيلم العلوي بالحشية ، ثم ضع الرقاقة على الفيلم السفلي وضع الحشية على الرقاقة. تأكد من عدم وجود غبار على الرقاقة.

بعد إغلاق درج الحرارية والطابعة ، قم بتطبيق 165 درجة مئوية من الحرارة و 620 نقطة خمسة / كيلو باسكال من الضغط من 100 ثانية. ثم قم بتبريد العينة إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تبرد ، قم بتنفيس الغرفة وسينخفض الضغط إلى صفر كيلو باسكال.

قم بلف لوح البوليسترين برفق لتحرير قالب AAO. اجمع 50 مل من دم الإنسان باستخدام أنبوب مثبط للهيبارين. ضع ستة ملليلتر من محلول عديد السكاريد المحب للماء في أنبوب سعة 15 مليلتر وأضف ثمانية ملليلتر من الدم إلى محلول عديد السكاريد المحب للماء.

يجب جمع الدم على الفور وإضافته ببطء فوق محلول عديد السكاريد المحب للماء. بعد الطرد المركزي للأنبوب عند 1020 مرة G لمدة 20 دقيقة لحبيبات الخلايا ، قم بحصاد طبقة الخلية غير الشفافة ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 15 ملليلترا. عند 10 ملليلتر من PBS التي تحتوي على 10٪ FBS في الطرد المركزي ، قم بالأنبوب عند 1020 ضعفا G لمدة 10 دقائق لحبيبات الخلايا.

قم بإزالة المادة الطافية وأضف المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء. بعد الحضانة على الجليد لمدة خمس دقائق في PBS التي تحتوي على 10٪ FBS والطرد المركزي للأنبوب عند 1020 مرة G لمدة خمس دقائق لتكسير الخلايا. قم بإزالة المادة الطافية وإضافة ملليلتر واحد من وسط تمدد الخلايا البطانية المكمل بنسبة 10٪ FBS.

بذور ثمانية نقاط صفر مليون خلية لكل بئر لكل طبق مشفر بالكولاجين. قم بتحفيز الخلايا المكونة للمستعمرة البشرية والأثيرية كما هو موضح في بروتوكول النص وقم بتنمية الخلايا إلى سبعة مرات لمزيد من التجارب. بعد ذلك ، قم بتغطية ألواح نمط النانو المتدرج بملليلتر واحد من محلول طلاء البروتين صفر نقطة واحد بالمائة في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بعمل تعليق من مركبات الكربون الكلورية فلورية البشرية من طبق الاستزراع بطريقة تقسيم الخلايا القياسية باستخدام التربسين. بعد تخفيف تعليق الخلية لتحقيق التقاء المطلوب ، تتوقف بذور مركبات الكربون الإلكترونية فلورية البشرية عن ألواح نمط النانو المتدرجة في عنصر تحكم مسطح. استزراع الخلايا على ألواح نمط نانو مسطحة أو متدرجة لمدة يومين في الحاضنة.

تظهر هذه الصور قوالب AAO المصنعة في ظل ثلاثة ظروف مختلفة لتوسيع الصب. أحد الجانبين الذي يحتوي على أقصر وقت مغمور في محلول نقش حمض الفوسفوريك له أصغر حجم للمسام ، في حين أن الجانب الآخر الذي لديه أطول وقت في محلول النقش له أكبر حجم للمسام. نظرا لأن نمط النانو تم نقله إلى البوليسترين من خلال طريقة الطباعة الحرارية ، يتم إنشاء هياكل أعمدة النانو على سطح البوليسترين ويتم الحفاظ على تدرج حجم قالب AAO في ألواح نمط النانو.

أظهرت مركبات الكربون الكلورية فلورية البشرية المتقاربة أن التشكل يعلم مستعمرة يمكن تمييزها بسهولة تحت مجهر تباين الطور. بعد يومين من زراعة مركبات الكربون الكلورية فلورية البشرية على سطح مسطح في ألواح نمط نانو متدرجة ، لوحظ نمو خيطي كبير في الخلايا المزروعة في GP 120 إلى 200. على العكس من ذلك ، لم يلاحظ أي تغيير ملحوظ في GP 200 إلى 280 أو GP 280 إلى 360 مقارنة بالتحكم المسطح.

تشير هذه النتيجة إلى أن استجابة الخلايا تختلف اعتمادا على حجم بنية النانو السطحية. هناك العديد من الخطوات لتصنيع لوحة نمط النانو. لذلك يمكن أن يكون الأمر معقدا في البداية ، ولكن بمجرد إتقانها ، ستحصل على أنماط ذات تدرج حجم الرغبات دون أي صعوبات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم كبير لكيفية إنتاج ألواح نمط نانو متدرجة وزراعتها للإنسان وسلسلة تشكيل مستعمرات أكثر ذكاء على لوحة نمط النانو. أيضا هذه الطريقة متاحة لأنواع مختلفة من السلاسل. يمكن أن توفر هذه الطريقة جسرا بين هندسة المواد والتكنولوجيا الحيوية التي ستساعد على فهم حقن الخلايا وتضاريس النانو السطحية.