اختبار الإصابة بالنبات: الرش والجرح بوساطة التلقيح بمسببات الأمراض النباتية رمادية ماجنابورثي

يمكن أن يساعد هذا الفيديو في إرشاد الطرق الرئيسية في مجال عدوى النبات مثل التلقيح المجاني والمطلوب بوساطة مع العامل الممرض النباتي Magnaporthe grisea. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن بروتوكول الرش والجرح يساهم في الفحص السريع والدقيق والواسع النطاق للأنماط المرضية للفطريات المعزولة. تتعلق الآثار المترتبة على هذه التقنية بدراسة علم وظائف الأعضاء لمكافحة مسببات الأمراض النباتية لأنها مهمة جدا للوقاية من الأمراض النباتية واسعة النطاق ومكافحتها.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لآلية الحفظ المسببة للأمراض في الفطريات. يمكن أيضا تطبيقه على المجموعة الرئيسية من النباتات الزراعية مثل الأرز أو الشعير. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه من الصعب كشط الكونيديا برفق باستخدام مسحات القطن المعقمة.

يعد عرض هذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث أن مجموعة من جروح الكشط دون اختراق الأوراق حيث أن الوسيلة الرئيسية لفصل الأرز أو أوراق الشعير أمر صعب. للبدء ، قم بوزن 30 إلى 50 جراما من دقيق الشوفان. يضاف دقيق الشوفان إلى 800 مل من الماء المقطر منزوع الأيونات ويغلى المزيج لمدة 30 دقيقة في قدر كهربائي.

بعد ذلك ، قم بتصفية خليط الشوفان المسلوق من خلال قطعة من الشاش في دورق ثم أضف 150 مل من عصير الطماطم و 20 جراما من أجار إلى الدورق أضف الماء المقطر منزوع الأيونات إلى الدورق حتى 1000 مل.

انقع حوالي 50 بذرة أرز في ماء مقطر منزوع الأيونات لمدة 3 أيام ثم لف البذور بشاش مبلل وأنبتها على ورق ترشيح رطب في أطباق بتري. بعد ذلك ، قم بزرع الشتلات في أواني ذات تربة تأصيص معقمة. بعد سقي الشتلات ، قم بتغطيتها بطبقة من الفيرميكوليت.

ضع الشتلات في منزل زجاجي يحفظ على حرارة 25 درجة مئوية لمدة أسبوع إلى أسبوعين. بعد ذلك ، استخدم مقصا جراحيا معقما لتقطيع ثلاث طبقات من ورق الترشيح إلى دوائر بطول ثمانية سنتيمترات. ضع دوائر ورق الترشيح على ألواح بلاستيكية معقمة مقاس 100 ملم.

أضف ما يكفي من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى كل طبق لنقع ورق الترشيح. ثم ضع اثنين من أعواد الأسنان المعقمة على بعد سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات في كل طبق ثقافة. بعد أسبوعين من البذر ، اجمع أوراق نباتات الأرز عن طريق قطع الجزء السفلي من الساق.

باستخدام ثقافة حاضنة ثرموستاتي ، سلالات M.grisea على ألواح OTA عند 25 درجة مئوية لمدة أربعة أيام. ثم استخدم ماصة لإضافة ملليلترين من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى كل لوحة. باستخدام حلقة التلقيح ، اكشط الفطريات من النوع البري والسلالات الطافرة في حطام الفطريات.

اجمع بقايا الفطريات وانقلها إلى لوحة OTA جديدة. ثم جفف حطام الفطريات في مقعد نظيف. أضف ملليلترين من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى طبق الفطريات المزروع واستخدم قطعة قطن معقمة لكشط الكونيديا برفق.

قم بتصفية تعليق الكونيديا من خلال طبقتين من ورق العدسة وانقل التعليق إلى أنبوب جديد مقاس 50 ملم. ثم الطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق عند 5000 مرة جم. بعد الطرد المركزي إزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات بمحلول Tween-20 مما يؤدي إلى تركيز 20 000 كونيديا لكل مليلتر.

صب المعلق في بخاخ يدوي ثم رش ما يقرب من 10 ملليلتر من المعلق المخروطي على أوراق نباتات الأرز التي يبلغ عمرها أسبوعين. رش أوراق نباتات التحكم بمحلول Tween-20. بعد ذلك ، احتضان الأوراق في صندوق رطب مظلم لمدة 24 ساعة.

بعد ذلك ، انقل الأوراق إلى غرفة رطبة مع ضوء الفلورسنت لمدة 12 ساعة. باستخدام إبرة تشريحية ، اكشط ثلاثة جروح بطول سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات في الأوردة الرئيسية لأوراق الأرز المنفصلة. ضع الأوراق المكشورة على أعواد الأسنان ورشها بمحلول Tween-20.

بعد ذلك ، قم بقطع سدادة فطرية نصف × نصف سنتيمتر من ألواح OTA التي تحتوي على كل سلالة M.grisea. ضع السدادات على الأوراق المصابة واحتضنها في غرفة رطبة عند 25 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى ثمانية أيام. بعد فترة الحضانة ، قم بفحص وتقييم الآفات وفقا لنظام التسجيل الذي يوفره المعهد الدولي لبحوث الأرز.

أخيرا ، قم بتصوير الأوراق المريضة لتقييم عدوى السلالات المختبرة. في هذا البروتوكول ، تم إجراء فحوصات عدوى النبات باستخدام سلالات M.grisea P131 و Com1 على شتلات الأرز الحساسة. أظهرت الأوراق البرية الملقحة P131 الآفات القوية النموذجية لانفجار الأرز.

ومع ذلك ، أظهرت الأوراق الملقحة Com1 عيوبا واضحة في العدوى ولم تتسبب في عدوى كاملة. لتحديد ما إذا كان M.grisea يمكن أن يصيب الخلايا المضيفة من خلال الجروح ، تم تلقيح الأوراق المتآكلة للنباتات البرية بسدادات فطرية أو قطرات مكونية. لم تظهر الأوراق الملقحة بالرش أي عيوب عدوى.

في المقابل ، أظهرت الأوراق التي تم تلقيحها عن طريق السدادات الفطرية عيوبا واضحة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم كشط ثلاثة جروح بطول سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات في الأوردة الرئيسية لأوراق الأرز المنفصلة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تلقيح مسببات الأمراض من أجل تحديد وتحليل مقاومة أمراض المحاصيل.

بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال مسببات الأمراض النباتية لاستكشاف مرض انفجار الأرز في الكائنات الحية الحديثة. لا تنس أن العمل مع Magnaporthe grisea يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات عند تنفيذ هذه الإجراءات.