عزل الخلايا اللحمية الرحم البشرية في المختبر ديسيدواليزيشن

يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب التناسلي حول الآليات الجزيئية الأساسية للإزالة ، وفهم أدوار جينات معينة في تدمير الخلايا اللحمية بطانة الرحم. توفر هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لعزل الخلايا اللحمية بطانة الرحم البشرية والتدمير الاصطناعي اللاحق عن طريق مكملات الهرمونات إلى وسائط الاستزراع. يمكن استخدام التعبير عن التغير الهرموني ، مثل البرولاكتين والبروتين المرتبط بعامل النمو الشبيه بالأنسولين لتأكيد وتحديد درجة التفريغ.

الأهم من ذلك ، تم إثبات جدوى هذا البروتوكول لإجراء ضربة قاضية خاصة بالجينات. نقل الخزعة بالملقط المعقم إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على عشرة ملليلتر من HBSF الطازج ، متبوعا بالطرد المركزي عند 500x G لمدة 90 ثانية. باستخدام ماصة سعة 1 مل ، قم بإزالة الوسائط وإضافة ثلاثة مل من وسائط عزل hES الدافئة مسبقا.

صب الخزعة في طبق 10 سم يحتوي على خمسة مل من وسائط عزل hES ، وابدأ في التقطيع باستخدام ملقط Dumont 5 ومقص غرزة مستقيمة دقيقة لمدة 20 دقيقة تقريبا. باستخدام ماصة مل واحدة ، انقل الخزعة المفرومة إلى أنبوب جديد سعة 50 مل ، وأضف سبعة مل إضافية من وسائط عزل hES إلى الطبق ، لنقل القطع المتبقية إلى أنبوب 50 مل. ثم قم بالطرد المركزي للعينة لمدة دقيقتين عند 800 درجة مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 1 مل.

بعد ذلك ، قم بتصفية DNase-1 ومزيج هضم الكولاجيناز من خلال مرشح 0.2 ميكرون متصل بحقنة سعة 10 مليلتر مباشرة على الحبيبات. ثم قم بدوامة الأنبوب لمدة 10 ثوان لإعادة تعليق الحبيبات ، واحتضانها لمدة 90 دقيقة في حمام مائي. بعد كل 10 دقائق ، قم بتدوير الأنبوب لمدة 10 ثوان للتأكد من هضم الأنسجة بشكل صحيح.

بعد الحضانة ، قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون مكدسة فوق أنبوب جديد سعة 50 مليلتر لاستعادة الخلايا اللحمية ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا المجمعة عند 800 × جم لمدة 2.5 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية برفق باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد ، مع التأكد من عدم إزعاج حبيبات الخلية. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من وسائط عزل hES الطازجة ، متبوعة بالطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 2.5 دقيقة.

بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق الخلايا في ستة ملليلتر من وسائط hES الطازجة. بعد ذلك ، لإزالة خلايا الدم ، ضع طبقة ببطء من الخلايا المعلقة على ثلاثة ملليلتر من وسائط تدرج الكثافة ، وقم بالطرد المركزي للعينة عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، اجمع المادة الطافية دون إزعاج وسائط تدرج الكثافة.

ثم أضف وسائط hES لجعل الحجم الإجمالي يصل إلى 10 ملليلتر ، وقم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى عند 800x G لمدة 2.5 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في ستة ملليلتر من وسائط hES. بعد ذلك ، قم بوضع الخلايا في قارورة 75 سم عن طريق إضافة ستة ملليلتر من إعادة تعليق الخلية و 10 ملليلتر من وسائط hES إلى القارورة ، متبوعا بالخلط اللطيف من خلال هز القارورة.

بعد الطلاء ، تحقق من كثافة الخلية تحت المجهر ، ثم قم بزراعة الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام ، مع التأكد من تغيير وسائط hES كل يومين. بعد 48 ساعة ، يجب أن تنمو الخلايا كطبقة أحادية. بشكل عام بعد خمسة أيام ، تحقق الخلايا التقاء 80 إلى 90٪ في قارورة 75 سم.

بالنسبة لتعداء الحمض النووي الريبي ، ابدأ بطلاء 800 ، 000 خلية لكل بئر في صفيحة من ستة آبار في ثلاث نسخ لكل حالة ، واحتضان الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة يومين للتحضير للتعدين. بعد يومين ، أضف 150 ميكرولترا من الوسائط الخالية من مصل Opti-MEM في أنبوب سعة خمسة مل ، متبوعا بإضافة خمسة ميكرولترات من كاشف التعداد. تخلط جيدا عن طريق الانعكاس ، وتحتضن لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من مصل Opti-MEM في أنبوب جديد بسعة خمسة مل ، متبوعا بإضافة 16 نانومول من SRC-2 siRNA. ثم أضف 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من مصل Opti-MEM في أنبوب سعة خمسة مل ، متبوعا بإضافة 16 نانومول للتحكم في siRNA. بعد الحضانة ، امزج كاشف التعدي المخفف مع SRC-2 siRNA واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات للأمام والخلف.

ثم امزج كاشف التعدي المخفف مع siRNA للتحكم واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات للأمام والخلف. ثم احتضان المجمعات لمدة خمس دقائق. خلال هذه الحضانة ، قم بسحب وسائط hES ، وأضف ملليلترا واحدا من وسائط التغيير إلى كل بئر.

بعد خمس دقائق من الحضانة ، قم بالطرد المركزي للمجمعات عند 500 × جم لمدة دقيقتين لجمع المحلول. ثم أضف 250 ميكرولترا من مجمعات كاشف نقل الحمض النووي الريبي إلى كل بئر تحتوي على خلايا ووسائط ، واخلطها عن طريق التأرجح اللطيف ، متبوعا بالحضانة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة خمس ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد خمس ساعات ، قم بشفط الوسائط وقم بالتغيير إلى وسائط hES ، واستمر في الحضانة لمدة يومين استعدادا لمقايسة إزالة الانبعاثات في المختبر.

بعد التعدي لمدة 48 ساعة وقبل بدء مقايسة الإزالة في المختبر ، اجمع الخلايا المنقولة siRNA و SRC-2 siRNA للتحكم في اليوم الصفري. أولا ، قم بشفط الوسائط واغسلها بمل واحد PBS لكل بئر. ثم قم بإزالة PBS ، وأضف 300 ميكرولتر من محلول تحلل الحمض النووي الريبي لكل بئر واحتضانه لمدة ثلاث دقائق.

بعد ثلاث دقائق من الحضانة ، اجمع الخلايا في المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي في أنبوب 1.5 مل لتحليله لاحقا. ثم قم بإعداد وسائط EPC عن طريق اقتباس الحجم المناسب لوسائط الإزالة ، وإضافة 10 نانو مولر استراديول ، وخلات ميدروكسي بروجستيرون ميكرومولار ، و 50 ميكرومولار أحادي فوسفات الأدينوزين الدوري في أنبوب 50 مل. بالنسبة للآبار الستة المتبقية في اليوم السادس ، أضف ملليلترين من وسائط EPC في كل بئر ، واحتضان الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة ستة أيام ، مع تغيير وسائط EPC كل 48 ساعة.

بعد اليوم السادس ، اجمع اليوم السادس للتحكم في siRNA واليوم السادس SRC-2 siRNA في المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي لتحليل المصب باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. يؤدي تحريض الإزالة بواسطة أسيتات هرمون الاستروجين ميدروكسي بروجستيرون وأدينوزين أحادي الفوسفات الدوري ، إلى إعادة ترتيب الهيكل الخلوي للخلايا اللحمية من الخلايا الليفية الممدودة إلى الخلايا الظهارية المستديرة. يكشف تلطيخ الفالودين للخلايا اللحمية بطانة الرحم عن خاصية إعادة تنظيم الهيكل الخلوي الليفي النشط لإزالة hES.

في الخلايا المعالجة بالمركبات ، تظل الخلايا ليفية في المظهر ، بينما في الخلايا المعالجة EPC ، ظهرت hES ظهارية مثل. لتأكيد فعالية مقايسة الإزالة في المختبر ، تم تقييم مستويات نسخ mRNA لعلامات إزالة البرولاكتين والبروتين المرتبط بعامل النمو الشبيه بالأنسولين -1 على مدى 6 أيام. عند إزالة الخلايا اللحمية بطانة الرحم البشرية ، زادت مستويات البرولاكتين و IGFBP1 بطريقة تعتمد على الوقت.

كما تم تأكيد الزيادة المعتمدة على الوقت في مستويات البرولاكتين المفرز من خلال فحص وسائط زراعة الأنسجة hES عبر طريقة ELISA. تم تقييم تأثيرات الضربة القاضية الخاصة بالجين على التغيرات الخلوية والجزيئية لإزالة الخلايا اللحمية لبطانة الرحم البشرية في اليوم السادس من الثقافة بعد تعداء siRNA لمدة 48 ساعة ، مع التحكم أو المنشط المشترك لمستقبلات الستيرويد 2 siRNA. أظهر التحكم siRNA المنقول hES تغيرات خلوية وجزيئية ، بما يتفق مع الإزالة المناسبة ، بما في ذلك التغيير المورفولوجي المرصوف بالحصى وزيادة مستويات النسخ لعلامات إزالة الانبعاثات PRL و IGFBP1.

في ضربة قاضية من SRC-2 siRNA ، ظلت hES ليفية في المظهر مقارنة بالتحكم siRNA المنقولة hES ، وأظهر انخفاضا كبيرا في مستويات نسخ PRL و IGFBP1. انخفضت مستويات نسخ SRC-2 بشكل ملحوظ في SRC-2 siRNA المنقول hES عند مقارنتها بالتحكم siRNA ، مما يشير إلى جدوى هذه الطريقة لإسكات الجينات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا اللحمية الأولية من خزعات بطانة الرحم لغرض إزالة الأخطاء في المختبر وإسقاط جين معين ذي أهمية باستخدام تعداء siRNA.