تخصيب اليورانيوم وتوصيف ميكرونفيرونمينتس المناعي والمناعة غير ورم في المنشأة الأورام مورين تحت الجلد

الهدف العام من هذه التقنية هو توفير طريقة للتنميط المتزامن لكل من كسور الخلايا المناعية والسرطانية التي تساهم في البيئة المكروية المناعية للأورام الصلبة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الأورام المناعية ، مثل التغيرات التسلسلية المناعية وغير المناعية التي تحدث داخل الورم بعد علاج معين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل التخصيب الفعال للمكونات المناعية وغير المناعية للورم ، مما يسمح بتنميط شامل للحالة المناعية للورم.

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحديد البيئة المكروية المناعية للورم بكفاءة وتحديد التغييرات الناجمة عن العلاج. بعد رش الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع تلوث الشعر ، قم بإزالة الأورام تحت الجلد جراحيا ، مع الحرص على خلو الأورام من أي أنسجة ملوثة. بعد ذلك ، ضع كل ورم في 1.8 مل من وسط RPMI 1640 الأساسي بدون مصل بقري للجنين في آبار فردية من صفيحة 24 بئرا على الجليد.

عندما يتم جمع جميع الأورام ، استخدم المقص لتقطيع العينات إلى قطع أقل من مليمتر مكعب واحد وأضف 200 ميكرولتر من كوكتيل التفكك 10X المحضر حديثا والذي يحتوي على كولاجيناز -1 ، كولاجيناز -4 ، و DNase واحد لكل بئر. بعد ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، في شاكر صفيحة مداري عند 60 إلى 100 دورة في الدقيقة ، قم بتحييد التفاعل باستخدام مليلتر واحد من وسط RPMI 1640 مكمل بنسبة 5٪ FBS واثنين من ملليمولار EDTA ، واستخدم طرف ماصة معدل سعة مليلتر واحد لنقل كل عينة من ملاط الورم إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 50 مليلتر تعلوها مصافي فردية 40 ميكرومتر. باستخدام مكبس حقنة سعة 10 مليلتر ، قم بفصل قطع الورم ميكانيكيا من خلال المصافي ، وشطف كل مصفاة بشكل دوري بملليلترين من RPMI 1640 متوسط بالإضافة إلى 5٪ FBS حتى تصبح المصافي خالية من الورم.

عندما يتم فصل جميع الأورام ، أضف وسيطا إلى كل أنبوب حسب الضرورة لإحضار جميع العينات إلى نفس الحجم وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك، استخدم ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر لإعادة تعليق الكريات في ملليلترين من الوسط المكممل FBS لكل أنبوب. لفصل كسور الخلايا المناعية والسرطانية ، أضف ثلاثة ملليلتر من وسط تدرج الكثافة إلى قاع أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مليلتر لكل عينة وقم بوضع طبقة ببطء ملليلترين من تعليق الخلايا السرطانية أسفل جانب كل أنبوب على كل تدرج.

احرص على التأكد من خلط معلقات الخلايا السرطانية جيدا قبل وضع الطبقات ، وأن معلقات الخلايا يتم تمريرها ببطء أسفل جانب الأنابيب ، وأن الأنابيب يتم التعامل معها بعناية لمنع اختلاط الطبقات. افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي المتدرج للكثافة واجمع بعناية الوسط العلوي وطبقات الكريات البيض المتسللة للورم في أنبوب واحد جديد سعة 15 مليلتر لكل عينة. تخلص من وسائط التدرج المتبقية للكثافة وأعد تعليق كريات الورم في ملليلترين من المتوسط بالإضافة إلى FBS لكل أنبوب.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لجميع العينات وأعد تعليق الورم الذي يتسلل إلى الكريات البيض في 200 ميكرولتر والخلايا السرطانية في ملليلترين من المتوسط بالإضافة إلى FBS لكل أنبوب على الجليد. لطلاء الخلايا ، قم بتسمية لوحة واحدة ذات 96 بئرا على شكل حرف U لكل لوحة تلطيخ مناعية بالإضافة إلى لوحة إضافية لعدد الخلايا وقم بتقسيم معلقات الخلية المفردة في كل لوحة من ألواح التلطيخ ولوحة الكلس. اغسل الخلايا مرتين ب 200 ميكرولتر من PBS من Dulbecco لكل عينة وسد الخلايا ب 50 ميكرولترا من كتلة FC لكل بئر لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

في نهاية حضانة الحجب ، أضف 50 ميكرولترا من الجسم المضاد خارج الخلية المركز 2X وخليط البقع القابل للإصلاح إلى كل بئر لمدة 30 دقيقة في الظلام. في نهاية حضانة التلوين ، اغسل العينات مرتين باستخدام عازلة FACS وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من محلول التثبيت والنفاذية طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، محمية من الضوء. في اليوم التالي ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، متبوعا بغسل 200 ميكرولتر من مخزن النفاذية لكل بئر.

قم بتسمية الخلايا ب 100 ميكرولتر من لوحة تلطيخ الأجسام المضادة داخل الخلايا في مخزن مؤقت للنفاذية لمدة 30 دقيقة في الظلام ، متبوعا بغسل مخزن مؤقت آخر للنفاذية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام المخزن المؤقت FACS وأعد تعليق العينات في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS الطازج لتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. ينتج عن هضم الورم ، كما هو موضح ، مع أو بدون إثراء متوسط تدرج الكثافة ، ما يقرب من 70 إلى 90٪ من الخلايا السرطانية الكاملة القابلة للحياة كما تم تقييمها بواسطة قياس التدفق الخلوي.

يعزز تخصيب متوسط التدرج الكثافة زيادة أكبر من ضعفين في جزء الكريات البيض الإيجابي CD45 ، مقارنة بهضم الورم غير المخصب ، بالإضافة إلى العديد من المجموعات الفرعية للخلايا المناعية التي يتم ملاحظتها بشكل شائع في دراسات البيئة المكروية المناعية. يمكن أيضا تحديد جزء الخلية السرطانية السلبية CD45 للعديد من ميزات الورم ، مثل قابلية الورم للبقاء الإجمالي أو موت الخلايا المبرمج ، وقدرة التكاثر ، والتعبير عن العديد من العلامات المثبطة للمناعة. لتحديد كيفية اختلاف المجموعات الفرعية المناعية للنخاع والخلايا الليمفاوية في جميع أنحاء ورم صلب واحد ، يمكن تقسيم الورم إلى أربعة أجزاء متساوية بحيث يحتوي كل قسم على مناطق متساوية تقريبا داخل الورم ، بالإضافة إلى أجزاء متساوية من الجلد والبريتوني.

يمكن بعد ذلك هضم كل قطعة بشكل منفصل وتحليلها ، كما هو موضح ، لوجود مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون أربع إلى 8 ساعات اعتمادا على عدد العينات التي لديك. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم العمل بسرعة ولكن بكفاءة للحفاظ على صلاحية الخلية.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث تتضمن خطوات الفصل والفصل تقنيات يصعب تعلمها من خلال النص المكتوب وحده. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء قياس التدفق الخلوي للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية تغير التجمعات الخلوية داخل الورم ، سواء من حيث الوفرة أو النمط الظاهري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فصل وتحليل كل من المكونات المناعية وغير المناعية لورم الفئران تحت الجلد باستخدام تقنيات فصل التدرج الهضمي والكثافة.