قمع الإشارات برو تليفية يقوي التي تعالج بوساطة معامل إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية الماوس في Cardiomyocytes المستحث

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إعادة برمجة القلب ، مثل تحديد المسارات التي تعزز أو تصلح تكوين عضل القلب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا توليد خلايا عضلة القلب المستحثة وظيفيا ، بكفاءة أعلى من الطرق المنشورة سابقا. تؤدي أمراض القلب الكيميائية هذه إلى فقدان خلايا عضلة القلب وضعف وظائف القلب.

لذلك ، قد تساعد هذه التقنية في الإصلاح العالي ، عن طريق تحويل الخلايا الليفية إلى خلايا عضلة القلب المستحثة وظيفيا. لبدء إنتاج الفيروسات القهقرية ، قم بزراعة خلايا Platinum E أو PE في وسط PE. استكملها بعلامات الاختيار في طبق 10 سم ، في خزانة من مستوى السلامة الحيوية الثانية.

كل يومين تمر الخلايا ، من واحد إلى أربعة ، أو من واحد إلى خامس. قبل يوم واحد من التعداء المخطط له ، قم بزرع خلايا PE في 10 مل من وسط النمو ، في طبق استزراع 10 سم ، ثم هز الأطباق برفق ذهابا وإيابا. ضع الأطباق بعناية في حاضنة ، للسماح بالتوزيع المتساوي للخلايا ، واحتضانها لمدة 24 ساعة.

في يوم التعدي ، أضف كوكتيل GHMT2M إلى أنبوب سعة 1.5 مل. أضف بعد ذلك 360 ميكرولترا من وسائط المصل المخفضة إلى أنبوب منفصل سعة 1.5 مل. بعد ذلك ، أضف 36 ميكرولترا من كاشف التعدي إلى وسط المصل المخفض ، ونفض الأنبوب برفق للخلط.

احتضان درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. يرتبط كاشف التعداء المستخدم في هذه الخطوة بالبلاستيك. لتجنب كفاءة التعدي ، احرص على سحب كاشف الإرسال مباشرة في وسط المصل المخفض ، وتجنب لمس طرف الماصة بجدار الأنبوب.

ثم أضف خليط كاشف تعداء وسائط المصل المختزل إلى الأنبوب ، الذي يحتوي على كوكتيل GHMT2M DNA. قم بتحريك الأنبوب برفق للخلط ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أخيرا ، أضف خليط تفاعل التعدي إلى خلايا PE.

حرك الطبق برفق لمدة 10 إلى 15 ثانية. احتضان الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 20 ساعة. الآن قم بتغطية أطباق 60 مم بالكولاجين ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، لمدة ساعتين على الأقل.

ثم قم بتوزيع الخلايا الليفية الجنينية المذابة حديثا في الأطباق المغطاة بالكولاجين. وأضف وسط النمو إلى الحجم النهائي ، 4 مل لكل طبق 60 مم. هز الأطباق برفق وضعها في الحاضنة.

عند طلاء MEFs ، من المهم أن يتم طلاء الخلايا بالتساوي. تجنب تحريك الأطباق ، فقد يتسبب ذلك في طلاء غير متساو. بدلا من ذلك ، قم بهز الطبق برفق ذهابا وإيابا ، وضعه بحذر في الحاضنة.

بعد 24 ساعة من تعداء خلايا البولي إيثيلين ، استخدم حقنة 30 مل لجمع وسط الفيروسات القهقرية الناتجة عن الخلايا. مرر المجموعة الأولى من وسط الفيروسات القهقرية من خلال مرشح بحجم 45 ميكرومتر ، في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ثم أضف 10 مل من وسط النمو الطازج على جدار الطبق ، مع الحرص على عدم إزاحة خلايا البولي إيثيلين.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أخرى. بعد ذلك ، أضف 7.2 ميكرولتر من 10 مجم لكل مليلتر كاشف نقل بروميد هيكسيدين ميثرين ، إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل الذي يحتوي على مادة طافية فيروسية. الآن استنشق الوسيط من MEFs ، وأضف 4 مل من وسط الفيروسات القهقرية الذي تم حصاده حديثا إلى الطبق.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 48 ساعة من تعداء الخلايا البكتيرية ، اجمع وسط الفيروسات القهقرية ، وقم بإجراء النقل بنفس الطريقة تماما ، كما هو الحال بالنسبة للمجموعة الأولى. تخلص من خلايا PE بعد المجموعة الثانية من وسط الفيروسات القهقرية وأضف 10٪ مبيض لجميع المواد الملامسة لوسط الفيروسات القهقرية.

بعد الحضانة ، استنشق وسط الفيروسات القهقرية من MEFs ، وأضف 4 مل من وسط ICM ، الذي يحتوي على 05 ميكرومولار ، مثبط مستقبلات TGF Beta Type 1. كل يومين قم بتغيير وسيط ICM ، حتى الاستخدام الآخر. لبدء التلوين المناعي ، قم بشفط وسط ICM من اليوم 14 المعاد برمجة MEFs.

ثم اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 مل من 1X مثلج بارد PBS ، لكل بئر من 12 لوحة بئر. بعد ذلك ، قم بشفط PBS ، وأضف 500 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهايد لإصلاح الخلايا ، واحتضانه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد شفط بارافورمالدهيد ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS.

بعد شفط PBS ، أضف 500 ميكرولتر من. 02٪ تريتون × 100 ، واحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد شفط Triton X 100 ، قم بسد الخلايا ب 500 ميكرولتر من مصل الحصان بنسبة 10٪ ، لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بشفط مصل الحصان ، وأضف 500 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف. احتضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد شفط الجسم المضاد الأساسي ، اغسل ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS.

بعد الغسيل الأخير ل PBS ، أضف 500 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف. لف الطبق بورق القصدير واحتضنه في الظلام لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، استنشق الجسم المضاد الثانوي ، واغسله ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS.

لف الطبق بورق القصدير ، واحفظه على حرارة أربع درجات مئوية حتى يتم التصوير. تظهر هذه الطريقة التحويل عالي الكفاءة ل MEFs إلى خلايا عضلة القلب. تحليل قياس التدفق الخلوي التمثيلي, إضافة اليوم التاسع بعد التنبيغ, يظهر تنشيط القلب تروبونين تي تعبير, في حوالي 70٪ من الخلايا.

وبالمثل ، لوحظ تعبير ألفا أكتينين القلب في حوالي 55٪ من الخلايا ، عند مقارنته بالتحكم في نقل GFP. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر التلوين المناعي لعلامات القلب ، التي يتم إجراؤها بعد أسبوعين من التنبيغ ، أن غالبية الخلايا تعبر عن Troponin I و Alpha-actinin و Troponin T. كما تم اكتشاف بروتين تقاطع الفجوة Cx43 على طول محيط ICMs. علاوة على ذلك ، فإن وضع العلامات المشتركة ل ICMs مع Alpha-actinin ، أو Troponin T و Cx43 ، يكشف عن تكوينات تقاطعات الفجوة بين الخلايا المجاورة.

يعيد نقل GHMT2M ، والعلاج ب A83O1 ، برمجة جزء صغير من MEFs ، إلى خلايا نابضة بحلول اليوم الثامن. في اليوم 11 ، لوحظ ما يقرب من 10000 زنزانة ضرب لكل سنتيمتر مربع. يتم الكشف عن عابرات الكالسيوم العفوية في ضربات عضلة القلب.

إضافة ناهض بيتا الأدرينالية إيزوبروتيرينول, يزيد بشكل كبير من تواتر العابرين للكالسيوم تلقائي. في المقابل ، فإن الفتنة من حاصرات قنوات الكالسيوم من النوع L نيفيديبين ، تقلل بشكل كبير من تواتر عابرات الكالسيوم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدى المرء فهم جيد لكيفية إعادة برمجة الخلايا الليفية ، إلى خلايا عضلية قلبية وظيفية مستحثة بكفاءة عالية.

باتباع هذا البروتوكول ، يمكن استخدام طرق أخرى ، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي وتسلسل الرقائق ، للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل التعبير الجيني العالمي وحالة الكروماتين ، أثناء إعادة برمجة القلب. لا تنس أن العمل مع الفيروسات القهقرية يمكن أن يكون خطيرا. يجب دائما تنفيذ الاحتياطات ، مثل العمل في خزانة السلامة البيولوجية من المستوى الثاني ، وارتداء معدات الحماية الشخصية ، والتخلص السليم من جميع نفايات الفيروسات القهقرية ، أثناء تنفيذ هذا البروتوكول.