مجهرية التعريب متعدد الألوان البروتينات الغشاء واحدة في العضيات الحية خلايا الثدييات

يمكن لهذه التقنية الإجابة على الأسئلة الرئيسية في العمليات التنظيمية مثل الدور الذي تلعبه ديناميكيات البروتين والتنظيم في التكيف الوظيفي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراؤها في الخلايا الحية ، وبالتالي الكشف عن ديناميكيات البروتين على مستوى الجزيء الفردي. على الرغم من أن هذه الطريقة تم تنفيذها في الأصل لتوفير رؤى حول التنظيم الزماني المكاني لبروتينات غشاء الميتوكوندريا ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على العضيات الأخرى وبروتينات الغشاء الأخرى.

سيظهر هذه التقنية تيمو أبلهانز ، طالب دراسات عليا من مختبري. بعد نقل وتحضير عينات الخلايا والمجهر وفقا لبروتوكول النص ، قم بتركيب العينة المحضرة بخرز الفلورسنت في حامل العينة بين حلقة PTFE والحلقة المطاطية الحمراء. ابدأ المجهر وجميع مكونات الأجهزة وجميع البرامج اللازمة للفحص المجهري.

استخدم منديلا جديدا خاليا من النسالة مرشوشة بالأيزوبروبانول لتنظيف العدسة الموضوعية وأسفل زلة الغطاء. ثم ضع قطرة من زيت الغمر على تلميذ العدسة الموضوعية. بعد ذلك ، ضع حامل العينة مع عينة الخرزة على مرحلة المجهر بحيث يلامس الجزء السفلي من زلة الغطاء الزيت.

ثم ركز على الخرزات باستخدام ضوء الإرسال أو خط الليزر. اضبط قوة ليزري الإثارة لتحقيق كثافة إشارة مماثلة في قناتي التألق. ثم ابحث عن منطقة بها العديد من إشارات الفلورسنت المميزة.

قم بإنشاء عرض مدمج لقنوات الفلورسنت باستخدام برنامج التحكم في الكاميرا. ثم استخدم البراغي الموجودة في مقسم الصور لإمالة مقسم الصور البصري الداخلي يدويا لتحقيق أفضل تراكب للإشارات من قناتي الفلورسنت. ابدأ تشغيل برنامج التحكم في المجهر TIRF واختر عرض القنوات الفردية في وضع البث المباشر.

التقط صورة لقطة ، فلورسنت مثير في جميع القنوات. ثم استخدم هذه الصورة لإنتاج مصفوفة التحويل. ابدأ المكون الإضافي لتحليل البرامج وقم بتحميل الصور ثنائية اللون المسجلة مسبقا لخرز الفلورسنت في البرنامج.

اختر الاتجاه المستخدم لقنوات الفلورسنت. انقر فوق نعم عند مطالبتك بمعايرة الصور، وحدد اللقطة التي تم التقاطها مسبقا. افتح مدير الوحدة لتحديد عوامل تحويل الوحدة، ثم افتح مدير الترجمة.

لتحديد وظيفة انتشار النقاط ، أو PSF ، اضغط على الزر PSF Radius. في نافذة PSF Estimator التي تفتح، حدد الفتحة العددية والحد الأقصى للإرسال. ثم انقر فوق تقدير نصف قطر PSF.

بعد ذلك ، اقبل PSF التجريبي الذي تم الحصول عليه. حدد مربع التقييم وعدد حلقات الانكماش وعدد نوى الكمبيوتر المستخدمة للحساب. ثم اضغط على Localize لبدء تركيب توزيع شدة الجسيمات المفردة ، باستخدام دالة Gaussian متماثلة ثنائية الأبعاد.

افتح مدير المعايرة. في الصورة المدمجة المعروضة للقناتين ، سيتم عرض الإشارة الأصلية والمراكز المترجمة. اختر وضع Affine.

ثم قم يدويا بتوصيل الأزواج المقابلة من المراكز المترجمة في القناتين ، التي نشأت من نفس حبة الفلورسنت ، عن طريق رسم خط اتصال. قم بتوصيل الإشارات المقابلة الموزعة على مجال الرؤية. ثم اضغط على قبول، واحفظ مصفوفة التحويل.

لإجراء تصوير جزيئي واحد لبروتينات غشاء الميتوكوندريا ، قم بتركيب زلة غطاء العينة بين حلقات المطاط و PTFE. ثم املأ الغرفة ب 0.5 إلى 0.8 مل من وسط التصوير. قم بتنظيف العدسة الموضوعية وأسفل زلة الغطاء.

ثم استخدم ضوء الإرسال أو خط الليزر للتركيز على الخلايا ، بعد إضافة قطرة من الزيت إلى العدسة. ثم اضبط قوة ليزري الإثارة لتحقيق شدة مماثلة ، وابحث عن منطقة بها العديد من إشارات الفلورسنت. اضبط زاوية الإضاءة في برنامج التحكم في المجهر TIRF لإنشاء زاوية سقوط أصغر من الزاوية الحرجة ، أو وضع TIR ، لإثارة منطقة الاهتمام المحددة عبر ورقة HILO.

تكييف إضاءة مجهر TIRF لإثارة عضيات الخلية باستخدام إضاءة HILO حكما سريعا على نسبة الإشارة إلى الخلفية والخبرة في الفحص المجهري TIRF ، بالإضافة إلى معرفة مورفولوجيا الخلية. اضبط كسب EM واختر وقت التعرض المناسب للتجربة التي تجمع فوتونات كافية لكل إطار. ثم اضبط طاقة الليزر من أجل تحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية ، حيث تتوافق هذه النسبة بشكل مباشر مع دقة التوطين.

ابحث عن منطقة في محيط الخلية بها إشارات ميتوكوندريا ممدودة غير متداخلة وممدودة وإشارات أحادية الجزيء. إذا لم تكن هناك إشارات واحدة مرئية في إحدى القناتين أو كلتيهما ، فانتظر حتى يؤدي التبييض إلى ظهور إشارات أحادية الجزيء. في حالة الحاجة إلى تبييض قناة واحدة فقط ، قم بإيقاف تشغيل ليزر القناة الأخرى ، لتجنب التبييض ، قبل تسجيل هذه القناة.

سجل حتى يصبح عدد الإشارات منخفضا جدا بحيث لا يمكن استمراره بشكل معقول. ابدأ برنامج معالجة التصوير وتحقق من هياكل الميتوكوندريا عن طريق إنشاء صورة تراكمية بمجموع مقدم لا يقل عن 1,000 إطار مسجل. ابدأ المكون الإضافي لتحليل البرامج.

لإجراء معالجة البيانات للترجمة والتتبع، قم بتحميل البيانات الأولية. تحقق من الألوان المتعددة. اختر الاتجاه الصحيح لكلتا القناتين.

عند طلب معايرة الصور، قم بتحميل مصفوفة التحويل. سيتم عرض القنوات بشكل منفصل. افتح البيانات الأولية من حاوية الصورة بالنقر فوق إظهار.

ثم افتح مدير الوحدة في علامة التبويب العلوية ، وحدد عوامل تحويل الوحدة في كل قناة. افتح مدير الترجمة في علامة التبويب العلوية، وحدد مربع التقييم وعدد حلقات الانكماش. انقر فوق PSF Radius لفتح مقدر PSF.

قم بتعيين الفتحة العددية والحد الأقصى للانبعاث للحصول على قيمة PSF النظرية. اضغط على قبول. كرر هذا لجميع القنوات.

ثم اضغط على Localize لبدء توطين الجسيم الفردي للإشارات المسجلة في كلتا القناتين. انتظر حتى ينتهي البرنامج. الآن ، يتم الحصول على صورة فائقة الدقة لكل قناة في حاوية الصورة للمكون الإضافي لتحليل البرامج.

PINK1 هو عامل مهم يضمن وظائف الميتوكوندريا. لتحديد توطين PINK1 بالنسبة إلى Tom20 في الميتوكوندريا الوظيفية والمختلة وظيفيا ، تم تسجيل سلسلة زمنية من 1000 إطار. أظهرت الصورة التراكمية لجميع الإشارات بمرور الوقت من قناة واحدة أن PINK1 كان موضعيا في العصارة الخلوية ، في الغشاء الخارجي ، وداخل الميتوكوندريا في ظل الظروف العادية ، ولكن بشكل تفضيلي في الغشاء الخارجي للميتوكوندريا منزوعة الاستقطاب.

كما تظهر الصور المجمعة للجسيمات الموضعية ، يتم توزيع PINK1 بشكل أساسي داخل الميتوكوندريا المستقطبة ، بينما يتم توطين Tom20 في غشاء الميتوكوندريا الخارجي. يصبح هذا أكثر وضوحا في الصورة المدمجة لجزيئات Tom20 و PINK1 الموضعية ، مما يدل على أن توزيع بروتين الغشاء الخارجي Tom20 أوسع بكثير. للتحقق من توطين PINK1 داخل الميتوكوندريا ، تم دمج الوحدة الفرعية 30 كيلوڈالتون لمركب الجهاز التنفسي الأول مع GFP القابل للتنشيط الضوئي وتسجيلها بواسطة الفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي الفلوري.

تظهر الصورة الثلاثية التراكمية وتوزيع المقطع العرضي تراكب المركب واحد و PINK1 ، مما يؤكد استيراد PINK1 كامل الطول. توضح هذه البيانات أن المجموعات السكانية الفرعية ل PINK1 تشغل العديد من المقصورات الدقيقة للميتوكوندريا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 20 ساعة ، بما في ذلك تسجيل البيانات ومعالجتها اللاحقة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اختبار حركة العضية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تحديد التوطين النسبي للبروتينات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تتبع الجسيم الفردي لبروتينات الميتوكوندريا لمراقبة سلوكهم في Z2 ، وظروف التمثيل الغذائي المختلفة ، وتحت الضغط.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الفحص المجهري ثنائي العمود لبروتينات الميتوكوندريا للكشف عن موقعها الفرعي للعضية والاتجار بها.