محسن المقايسة الصفر للاختبار في المختبر للهجرة الخلية مع كاميرا بصرية الآلي
August 8th, 2018
هنا يصف لنا إجراء اختبار في الخلية الهجرة في المختبر مع مجهر كاميرا بصرية الآلي. والرزن الصفر قد استخدمت على نطاق واسع حيث يتبع إقفال نقطة الصفر لفترة زمنية محددة. المجهر الضوئي تمكن من كشف خلية الهجرة رخيصة ويمكن الاعتماد عليها.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك إلقاء نظرة على الخلايا في الوقت الفعلي في المجهر البصري التلقائي. تمتد الآثار المترتبة على هذا العلاج إلى علاج الجروح المزمنة أو السرطان حيث تلعب الهجرة دورا حاسما في هذه الأمراض. ابدأ بغسل مزرعة متجمعة من خلايا HaCaT مرتين بخمسة ملليلتر من المغنيسيوم المعقم والبوليزومات الخالية من الكالسيوم لكل غسلة.
بعد ذلك ، احتضن الخلايا بمليلتر واحد من التربسين في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى ثماني دقائق. بعد تأكيد الانفصال تحت المجهر الضوئي ، أوقف التفاعل الأنزيمي بتسعة ملليلتر من وسط الثقافة المكملة ب FBS. وقم بتخفيف الخلايا إلى 7.5 في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل 250 ميكرولتر من المتوسط بالإضافة إلى تركيز FBS.
بعد ذلك ، قم بزرع 250 ميكرولترا من الخلايا في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة ذات القاع المستدير المكونة من 48 بئرا ، وحرك اللوحة برفق من جانب إلى آخر لضمان توزيع الخلايا بالتساوي عبر قيعان الآبار. ثم انقل اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا. عندما تصل الثقافات إلى التقاء 90 إلى 95٪ ، استبدل المادة الطافية في كل بئر ب 250 ميكرولتر من الوسط المحضر حديثا مع 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الميتومايسين C ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة ساعتين أخريين.
في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ب 250 ميكرولتر من PBS وأضف 250 ميكرولترا من PBS الطازج إلى كل بئر. ثم استخدم طرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر لعمل خدش رأسي واحد في كل طبقة أحادية الخلية. عندما يتم خدش جميع الطبقات الأحادية ، استبدل PBS في كل بئر ب 250 ميكرولترا مع حافز الببتيد ذي الأهمية وقم بتركيب اللوحة في نظام كاميرا بصرية مع الغطاء سليما.
لإعداد الكاميرا البصرية ، افتح نافذة الاستحواذ وحدد التئام الجروح. حدد نوع اللوحة وقم بإلغاء تحديد الآبار غير المستخدمة. انقر بعد ذلك فوق تمكين وانقر بزر الماوس الأيمن على أحد الآبار لضبط التركيز ليناسب موضع الخلايا.
اضبط الفترة الزمنية للصور ضمن الفاصل الزمني للصورة واضبط عدد التكرارات لتناسب الفترة المطلوبة. ثم حدد نوع التحليل المناسب. ثم انقر فوق ابدأ لبدء تصوير الخلايا.
عندما يحدث الجرح ، تبدأ خلايا الجلد في التكاثر والهجرة عبر فراش الجرح لإغلاق الجرح ، وهي عملية يمكن ملاحظتها من خلال الكاميرا البصرية. بعد حضانة لمدة 48 ساعة ، يؤدي علاج عامل النمو البطاني إلى إغلاق الجرح بنسبة 95٪ تقريبا ، مقارنة بإغلاق 38٪ في آبار التحكم غير المعالجة ، و 33 و 62٪ إغلاق في مزارع اللاكتوفيرين واللاكتوفيريسين على التوالي. يمكن أيضا رسم النسبة المئوية لإغلاق الجرح التي تم تحديدها من التغيرات في عرض الفجوة من الخدش الأولي لكل حافز للنمو.
يصف هذا الفيديو بروتوكولا مباشرا وفعالا لدراسة هجرة الخلايا الكيراتينية عبر خدش مصنوع في طبقة أحادية من الخلايا السليمة. على الرغم من أن الخلايا المستخدمة في هذا الاختبار هي خلايا HaCaT ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيق الطريقة على خطوط الخلايا الأخرى أو الفطريات أو حتى البكتيريا ، طالما أنها ملتصقة بالجزء السفلي من صفيحة الميكروتيتر.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة إجراءً لاختبار هجرة الخلايا في المختبر باستخدام مجهر كاميرا بصرية آلي. تم تمييز اختبار الخدش كوسيلة موثوقة لمراقبة هجرة الخلايا مع مرور الوقت.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- علم الأحياء المجهرية
- تقنيات في المختبر
الخلفية
- اختبار الخدش هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة هجرة الخلايا.
- توفر المجاهر البصرية الآلية مراقبة الخلايا في الوقت الفعلي.
- فهم هجرة الخلايا أمر بالغ الأهمية في علاجات الجروح المزمنة والسرطان.
- هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة ويمكن الاعتماد عليها لاكتشاف حركة الخلايا.
غرض الدراسة
- لإظهار طريقة موثوقة لتقييم هجرة الخلايا.
- لاستكشاف الآثار المترتبة على هجرة الخلايا في علاج الجروح المزمنة وعلاج السرطان.
- لاستغلال الفحص المجهري البصري الآلي للتحليل في الوقت الفعلي.
الطرق المستخدمة
- غسل ثقافات HaCaT المتراكمة باستخدام PBS.
- تحضين الخلايا مع التربسين للانفصال.
- إيقاف التفاعل الأنزيمي بمتوسط الثقافة.
- تخفيف الخلايا إلى تركيز محدد للتحليل.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق مراقبة هجرة الخلايا في الوقت الفعلي.
- أثبتت الطريقة فعاليتها في مراقبة إغلاق الخدش.
- يمكن أن تفيد النتائج في وضع استراتيجيات علاجية للجروح المزمنة والسرطان.
- يعزز الفحص المجهري الآلي من موثوقية تقييمات الهجرة.
الاستنتاجات
- المجهرالضوئي الآلي هو أداة قيّمة لدراسة هجرة الخلايا.
- يمكن لهذه التقنية أن تتقدم بالبحث في شفاء الجروح المزمنة وعلاجات السرطان.
- قد تؤدي الدراسات الإضافية إلى توسيع تطبيقاتها في سياقات بيولوجية مختلفة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Cell migration assays are critical for evaluating therapeutic candidates in wound healing and oncology, yet traditional scratch assays suffer from edge artifacts and manual analysis bottlenecks. This optimized protocol addresses reproducibility challenges by eliminating cation-mediated cell accumulation and integrating automated imaging, enabling consistent, quantitative migration readouts. The approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing reliable, real-time data on pro- and anti-migratory compounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying migration changes in response to stimuli like lactoferrin or growth factors.
- Operational Value: Reduces variability from manual scratch analysis and temperature fluctuations through automated optical imaging.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative wound closure metrics from identical scratch sections over time.
- Operational Value: Eliminates labor-intensive image cycling and analysis, improving throughput for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant HaCaT keratinocytes to model epithelial migration, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures assay continuity from discovery to preclinical evaluation via reproducible, automated workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early discovery and enabling quantitative lead identification through measurable migration inhibition or stimulation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating migration as a dependent variable in response to peptide or cytokine treatments.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., % wound closure) that allow comparison across compound libraries or protein variants.
- Analytics: Generates time-series migration data suitable for statistical comparison and dose-response modeling.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance through use of human keratinocyte cells and wound-healing context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for migration assays across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in migration assays.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through automated imaging and consistent scratch preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable, quantitative migration data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated migration effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture and sterile technique for monolayer preparation.
- Dependent on automated optical camera systems with time-lapse and analysis capabilities.
- Necessitates standardization of scratch width and timing across wells for comparable data.
- Involves optimization of PBS washing steps to prevent edge artifacts in different cell lines.
- Limited to adherent cells compatible with microtiter plate bottom attachment.
