محسن المقايسة الصفر للاختبار في المختبر للهجرة الخلية مع كاميرا بصرية الآلي
أغسطس 8, 2018
هنا يصف لنا إجراء اختبار في الخلية الهجرة في المختبر مع مجهر كاميرا بصرية الآلي. والرزن الصفر قد استخدمت على نطاق واسع حيث يتبع إقفال نقطة الصفر لفترة زمنية محددة. المجهر الضوئي تمكن من كشف خلية الهجرة رخيصة ويمكن الاعتماد عليها.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك إلقاء نظرة على الخلايا في الوقت الفعلي في المجهر البصري التلقائي. تمتد الآثار المترتبة على هذا العلاج إلى علاج الجروح المزمنة أو السرطان حيث تلعب الهجرة دورا حاسما في هذه الأمراض. ابدأ بغسل مزرعة متجمعة من خلايا HaCaT مرتين بخمسة ملليلتر من المغنيسيوم المعقم والبوليزومات الخالية من الكالسيوم لكل غسلة.
بعد ذلك ، احتضن الخلايا بمليلتر واحد من التربسين في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى ثماني دقائق. بعد تأكيد الانفصال تحت المجهر الضوئي ، أوقف التفاعل الأنزيمي بتسعة ملليلتر من وسط الثقافة المكملة ب FBS. وقم بتخفيف الخلايا إلى 7.5 في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل 250 ميكرولتر من المتوسط بالإضافة إلى تركيز FBS.
بعد ذلك ، قم بزرع 250 ميكرولترا من الخلايا في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة ذات القاع المستدير المكونة من 48 بئرا ، وحرك اللوحة برفق من جانب إلى آخر لضمان توزيع الخلايا بالتساوي عبر قيعان الآبار. ثم انقل اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا. عندما تصل الثقافات إلى التقاء 90 إلى 95٪ ، استبدل المادة الطافية في كل بئر ب 250 ميكرولتر من الوسط المحضر حديثا مع 10 ميكروغرام لكل مليلتر من الميتومايسين C ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة ساعتين أخريين.
في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ب 250 ميكرولتر من PBS وأضف 250 ميكرولترا من PBS الطازج إلى كل بئر. ثم استخدم طرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر لعمل خدش رأسي واحد في كل طبقة أحادية الخلية. عندما يتم خدش جميع الطبقات الأحادية ، استبدل PBS في كل بئر ب 250 ميكرولترا مع حافز الببتيد ذي الأهمية وقم بتركيب اللوحة في نظام كاميرا بصرية مع الغطاء سليما.
لإعداد الكاميرا البصرية ، افتح نافذة الاستحواذ وحدد التئام الجروح. حدد نوع اللوحة وقم بإلغاء تحديد الآبار غير المستخدمة. انقر بعد ذلك فوق تمكين وانقر بزر الماوس الأيمن على أحد الآبار لضبط التركيز ليناسب موضع الخلايا.
اضبط الفترة الزمنية للصور ضمن الفاصل الزمني للصورة واضبط عدد التكرارات لتناسب الفترة المطلوبة. ثم حدد نوع التحليل المناسب. ثم انقر فوق ابدأ لبدء تصوير الخلايا.
عندما يحدث الجرح ، تبدأ خلايا الجلد في التكاثر والهجرة عبر فراش الجرح لإغلاق الجرح ، وهي عملية يمكن ملاحظتها من خلال الكاميرا البصرية. بعد حضانة لمدة 48 ساعة ، يؤدي علاج عامل النمو البطاني إلى إغلاق الجرح بنسبة 95٪ تقريبا ، مقارنة بإغلاق 38٪ في آبار التحكم غير المعالجة ، و 33 و 62٪ إغلاق في مزارع اللاكتوفيرين واللاكتوفيريسين على التوالي. يمكن أيضا رسم النسبة المئوية لإغلاق الجرح التي تم تحديدها من التغيرات في عرض الفجوة من الخدش الأولي لكل حافز للنمو.
يصف هذا الفيديو بروتوكولا مباشرا وفعالا لدراسة هجرة الخلايا الكيراتينية عبر خدش مصنوع في طبقة أحادية من الخلايا السليمة. على الرغم من أن الخلايا المستخدمة في هذا الاختبار هي خلايا HaCaT ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيق الطريقة على خطوط الخلايا الأخرى أو الفطريات أو حتى البكتيريا ، طالما أنها ملتصقة بالجزء السفلي من صفيحة الميكروتيتر.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة إجراءً لاختبار هجرة الخلايا في المختبر (in vitro) باستخدام مجهر كاميرا بصري آلي. ويتم تسليط الضوء على مقايسة الخدش (scratch assay) كطريقة موثوقة لمراقبة هجرة الخلايا بمرور الوقت.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- المجهرية
- تقنيات في المختبر
خلفية علمية
- يُعد مقايسة الخدش تقنية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة هجرة الخلايا.
- توفر المجاهر الضوئية المؤتمتة ملاحظة للخلايا في الوقت الفعلي.
- يعد فهم هجرة الخلايا أمراً بالغ الأهمية في علاجات الجروح المزمنة والسرطان.
- تعتبر هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة وموثوقة للكشف عن حركة الخلايا.
الهدف من الدراسة
- لإثبات طريقة موثوقة لتقييم هجرة الخلايا.
- لاستكشاف آثار هجرة الخلايا في علاج الجروح المزمنة وعلاج السرطان.
- لاستخدام المجهر الضوئي الآلي للتحليل في الوقت الفعلي.
الطرق المستخدمة
- غسل المزارع المتلاحمة من خلايا HaCaT باستخدام PBS.
- حضن الخلايا مع التربسين لفصلها.
- إيقاف التفاعل الإنزيمي باستخدام وسط استنبات.
- تخفيف الخلايا إلى تركيز محدد من أجل التحليل.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق الملاحظة الآنية لهجرة الخلايا.
- أثبتت الطريقة فعاليتها في مراقبة انغلاق الخدش.
- يمكن أن تساهم النتائج في توجيه الاستراتيجيات العلاجية للجروح المزمنة والسرطان.
- يعزز المجهر الآلي من موثوقية تقييمات الهجرة.
الاستنتاجات
- يعد المجهر الضوئي الآلي أداة قيمة لدراسة هجرة الخلايا.
- يمكن لهذه التقنية أن تدفع عجلة الأبحاث في مجال التئام الجروح المزمنة وعلاجات السرطان.
- قد تعمل الدراسات المستقبلية على توسيع تطبيقاتها في سياقات بيولوجية متنوعة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
تُعد اختبارات هجرة الخلايا ضرورية لتقييم المرشحات العلاجية في مجالي التئام الجروح وعلم الأورام، ومع ذلك تعاني اختبارات الخدش التقليدية من تأثيرات الحواف الاصطناعية وعقبات التحليل اليدوي. يعالج هذا البروتوكول المُحسن تحديات تكرار النتائج من خلال القضاء على تراكم الخلايا بوساطة الكاتيونات ودمج التصوير الآلي، مما يتيح قراءات كمية ومتسقة للهجرة. ويدعم هذا النهج التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة وتقليل المخاطر الميكانيكية من خلال توفير بيانات موثوقة وفي الوقت الفعلي حول المركبات المحفزة والمثبطة للهجرة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس التغيرات في الهجرة استجابةً لمحفزات مثل اللاكتوفيرين أو عوامل النمو.
- القيمة التشغيلية: تقلل من التباين الناتج عن تحليل الخدش اليدوي وتقلبات درجات الحرارة من خلال التصوير البصري المؤتمت.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توفير مقاييس كمية ومعيارية لالتئام الجروح من مقاطع خدش متطابقة بمرور الوقت.
- القيمة التشغيلية: التخلص من عمليات تدوير الصور وتحليلها التي تتطلب جهداً كثيفاً، مما يحسن من إنتاجية فحص المركبات.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يستخدم خلايا HaCaT الكيراتينية ذات الصلة بالمرض لنمذجة الهجرة الظهارية، مما يدعم الموائمة مع المؤشرات الحيوية الانتقالية.
- القيمة التشغيلية: يضمن استمرارية المقايسة من مرحلة الاكتشاف إلى التقييم قبل السريري عبر سير عمل مؤتمت وقابل للتكرار.
تكامل سير العمل ومسار المعالجة
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، حيث تدعم اختبار الفرضيات في المراحل المبكرة من الاكتشاف، وتتيح التحديد الكمي للمركبات الرائدة من خلال قياس تثبيط أو تحفيز الهجرة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم توضيح المسارات من خلال عزل الهجرة كمتغير تابع استجابةً لمعالجات الببتيد أو السيتوكينات.
- الفحص: تقدم مخرجات كمية قابلة للتكرار (مثل % wound closure) تسمح بالمقارنة بين مكتبات المركبات أو متغيرات البروتين.
- التحليلات: تولد بيانات هجرة تسلسلية زمنية مناسبة للمقارنة الإحصائية ونمذجة الاستجابة للجرعة.
- البحث الانتقالي: تربط بالصلة قبل السريرية من خلال استخدام خلايا الكيراتين البشرية وسياق التئام الجروح.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: تؤسس منصة مؤتمتة وقابلة لإعادة الاستخدام لمقاييس الهجرة عبر مشاريع وأنواع خلايا متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في فحوصات الهجرة الخلوية.
- القيمة التشغيلية: تعزز التقييس وقابلية التوسع من خلال التصوير الآلي والتحضير المتسق لخدش الخلايا.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) من خلال توفير بيانات هجرة كمية وموثوقة في مرحلة مبكرة من المسار التجريبي.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات المركبات بناءً على مخاطر معدلة وفقاً لتأثيرات الهجرة التي تم التحقق من صحتها.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا والتقنيات التعقيمية لتحضير الطبقة الواحدة.
- يعتمد على أنظمة الكاميرات البصرية المؤتمتة المزودة بقدرات التصوير المتقطع (time-lapse) والتحليل.
- يستلزم توحيد عرض الخدش والتوقيت عبر الآبار لضمان الحصول على بيانات قابلة للمقارنة.
- يتضمن تحسين خطوات الغسل باستخدام PBS لمنع ظهور آثار اصطناعية عند الحواف في خطوط الخلايا المختلفة.
- يقتصر على الخلايا الملتصقة المتوافقة مع الارتباط بقاع أطباق المعايرة الدقيقة (microtiter plates).
