أسلوب بسيط واستنساخه تحضير عينات الغشاء من الفئران المعزولة حديثا ميكروفيسيلس الدماغ

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الأوعية الدقيقة الدماغية من دماغ الفئران لإجراء دراسات كيميائية حيوية تهدف إلى فهم الخصائص الجزيئية للحاجز الدموي الدماغي للثدييات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في فسيولوجيا الحاجز الدموي الدماغي وعلم الأدوية العصبية ، مثل التنظيم والتوطين والتعبير عن بروتينات التوصيل الضيقة والناقلات الذاتية في الصحة والمرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا عزل عدد كاف من الأوعية الدقيقة عالية الجودة عن فردي مع مراعاة التباين الطبيعي في التعبير عن البروتين بين الفردية.

ستظهر هذه التقنية بيانكا رايلي ، طالبة جامعية متميزة من مختبري. بعد القتل الرحيم وقطع رأس فأر Sprague-Dawley وفقا لبروتوكول النص ، استخدم مقصا جراحيا لاستئصال الجلد من جمجمة الفئران عن طريق عمل قطع عرضي واحد. باستخدام rongeurs ، قم بإزالة صفيحة الجمجمة بعناية ، وفضح الدماغ.

ثم ، باستخدام ملعقة ، قم بإزالة العضو. افصل المخ ، وضع أنسجة المخ المعزولة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مع خمسة ملليلتر من BMB و 5.0 ميكرولتر من كوكتيل مثبط البروتين. لمعالجة الأنسجة ، انقلها إلى طبق بتري نظيف.

بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، قم بلف الدماغ برفق على ورق ترشيح قطره 12.5 سم لإزالة السحايا الخارجية ، والتي تلتصق بشكل فضفاض بالقشرة الدماغية. خلال هذه الخطوة ، يجب توخي الحذر للتأكد من إزالة جميع الأنسجة السحائية من عينة أنسجة المخ. يمكن تصور السحايا على أنها نسيج غشائي شفاف يمكن سحبه بسهولة بعيدا عن أنسجة المخ.

اضغط برفق على أنسجة المخ على ورق الترشيح ، ولف المنديل مرة أخرى ، مع تقليب ورق الترشيح بشكل متكرر خلال هذه الخطوة. ثم ، باستخدام الملقط ، افصل الضفيرة المشيمية عن نصفي الكرة المخية. بعد ذلك ، قم بتسطيح أنسجة المخ برفق مرة أخرى ، واستخدم الملقط لإزالة البصيلات الشمية المجاورة للمادة البيضاء.

ضع أنسجة المخ القشرية في هاون زجاجي مبرد. ثم أضف خمسة ملليلتر من BMB مع كوكتيل مثبط البروتين. باستخدام الخالط العلوي ، أدخل مدقة في الملاط ، وقم بتجانس أنسجة المخ باستخدام 15 ضربة لأعلى ولأسفل عند 3 ، 700 دورة في الدقيقة.

ثم صب الجانس في أنابيب الطرد المركزي المسماة. بين العينات ، استخدم 70٪ من الإيثانول لتنظيف المدقة. لإجراء الطرد المركزي ، أضف 8.0 مل من محلول ديكستران بنسبة 26٪ إلى كل أنبوب طرد مركزي مصنف يحتوي على متجانس الدماغ.

اقلب الأنبوب مرتين ، ثم قم بتدوير العينة جيدا. قم بإجراء دوامة كل عينة باستخدام زوايا متعددة لضمان خلط شامل لمحلول متجانس الدماغ مع محلول ديكستران بنسبة 26٪. الطرد المركزي للعينات عند 5 ، 000 جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

استنشق المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 5.0 مل من BMB مع كوكتيل مثبط للبروتين. ثم, دوامة الحبيبات لضمان الخلط الشامل. بعد ذلك ، أضف 8.0 مل من 26٪ ديكستران إلى كل أنبوب طرد مركزي ، والدوامة كما هو موضح للتو.

ثم ، قم بالطرد المركزي للعينات مرة أخرى. باستخدام قارورة مفرغة وماصة زجاجية ، قم بشفط المادة الطافية ، وتأكد من عدم تعطل الحبيبات التي تحتوي على الوعاء الدقيق للدماغ. أعد تعليق الحبيبات في BMB باستخدام مثبط البروتياز ثم 26٪ ديكستران مرتين أخريين.

بعد الطرد المركزي النهائي ، أضف 5.0 مل من BMB إلى كل بيليه ودوامة لإعادة تعليق العينة. باستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو ، تم إجراء عزل ناجح للأوعية الدقيقة السليمة من دماغ الفئران. في هذه الصورة ، يتم تلطيخ الوعاء الدقيق باستخدام جسم مضاد ضد الشوفان 1a4 ، وهو ناقل يتم التعبير عنه جيدا في غشاء البلازما للخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ.

كما يتضح من اللطخة الغربية ، تم إثراء مستحضرات الغشاء من الأوعية الدقيقة التي تم حصادها من إناث فئران Sprague-Dawley في PECAM-1 ، المعروف أيضا باسم CD31 ، وهو بروتين علامة للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ. أثناء تحسين هذا البروتوكول ، لوحظ تخصيب PECAM في عينات الأغشية المعدة باستخدام خطوتين وأربع خطوات للطرد المركزي ديكستران. كما هو محدد من قبل اختبار بروتين برادفورد والمدرج في هذا الجدول ، تنتج مستحضرات الغشاء عادة تركيزات بروتين تتراوح بين 5.0 ملليغرام لكل مليلتر و 10.0 ملليغرام لكل مليلتر.

تم تحديد قيم البروتين بناء على منحنى قياسي تم إنشاؤه باستخدام BSA كمعيار قياسي. كما هو موضح هنا ، هو وصمة عار غربية لبروتين نقل BBB Glut1. تم الكشف عن نطاقات مفردة واضحة عند 54 كيلودالتون لبروتين BBB المعبر عنه للغاية في كل عينة غشائية.

هذا الرسم البياني تعبيرا أعلى عن Glut1 في BBB في ذكور الفئران مقابل إناث الفئران. لم يلاحظ أي فرق في التعبير عن الصوديوم / البوتاسيوم ATPase بين ذكور وإناث. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إلى ساعتين ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بجميع العينات على الجليد طوال البروتوكول وتوخي الحذر عند شفط المادة الطافية من حبيبات الوعاء الدقيق بعد خطوات الطرد المركزي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل تحليل الترسيب المناعي المشترك ، على عينات الأوعية الدقيقة للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ارتباط البروتينات المختلفة داخل نفس مركب البروتين في الحاجز الدموي الدماغي. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فسيولوجيا الحاجز الدموي الدماغي وعلم الأدوية العصبية لاستكشاف الخصائص الجزيئية للحاجز الدموي الدماغي في الصحة وفي نماذج القوارض للأمراض العصبية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الأوعية الدقيقة عالية الجودة من دماغ الفئران لدراساتك الخاصة في بيولوجيا الحاجز الدموي الدماغي في الصحة والمرض.