تقييم جدوى اتحاد البكتيرية الاصطناعية على واجهة المضيف-ميكروب القناة الهضمية في المختبر

هذا النموذج هو الخطوة التالية في تحديد الاتجاهات الدقيقة للمضيف للجهاز الهضمي العلوي. إنه يسمح بمعالجة أسئلة البحث الميكانيكي ويوفر العديد من الفرص للأغذية والأدوية وصناعة المغذيات وكذلك علم السموم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجمع بين نموذج لنظام الجهاز الهضمي والواجهة الدقيقة المضيفة بما في ذلك مجتمع ميكروبي معقد.

إنه قابل للتطبيق للغاية ومرن للغاية أيضا. يمكن اعتماد هذه المنهجية باستخدام أنواع الخلايا الأخرى لتقييم جدوى مسببات الأمراض والمعلومات اللاحقة. يمكن أيضا استخدام التغييرات للمساعدة في قدرة استعمار مخاليط البروبيوتيك وفي نهاية المطاف التأثير المحتمل للبكتيريا على الدورة الدموية الجهازية لكل

للبدء ، قم بتعقيم الوسط ، ثم أضف خمسة ميكروغرام لكل مليلتر من الهيمين وميكروغرام واحد لكل مليلتر من الميناديون. قم بتوزيع تسعة ملليلتر من الوسط في أنابيب Hungate ، وأغلق الأنابيب بسدادة مطاطية وغطاء من الألومنيوم. ثم اغسل الأنابيب بمزيج من 90٪ نيتروجين و 10٪ ثاني أكسيد الكربون.

استخدم المحقنة لاسترداد مليلتر واحد من الوسط اللاهوائي ، ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. اختر مستعمرات مفردة من كل نوع من أنواع البكتيريا وأعد تعليقها في الوسط. ثم انقل المستعمرات إلى BHI المعدل اللاهوائي ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

بعد الحضانة ، استخدم PBS المعقم المصفى لتخفيف الثقافات إلى 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. ثم استخدم قياس التدفق الخلوي مع صبغة يوديد البروبيديوم الخضراء الإلكترونية لقياس عدد الخلية. يعد تقييم تكوين مجتمع الميكروبيوم وقابليته للحياة أمرا ضروريا لتجنب التحيز في تجربتنا.

قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من القوارير ، ثم استخدم خمسة ملليلتر من PBS بدون كالسيوم أو مغنيسيوم لغسل الخلايا مرة واحدة. أضف ملليلترين من محلول التربسين EDTA إلى الخلايا. وزع المحلول عن طريق تحريك القارورة برفق.

ثم قم بإزالة 1.5 مل من محلول التربسين ، واحتضن القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد التحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا قد انفصلت ، أضف خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا المكمل إلى القارورة لتعطيل التربسين ، والماصة لأعلى ولأسفل للحصول على معلق أحادي الخلية متجانس. امزج على الفور 50 ميكرولتر من تعليق الخلية مع محلول أزرق معقم 0.4٪ في حجم 1: 1 إلى نسبة الحجم لخلايا KCO2 لحجم 1: 5 إلى حجم HT29MTX.

امزج عن طريق سحب العينة ، وقم بتحميل المعلق في غرفة العد قبل عد الخلايا تحت المجهر. بعد تحضير KCO2 و HT29MTX معلقات الخلايا وفقا لبروتوكول النص ، قم بتجانس المعلقات ، وأضف الحجم المقابل ل KCO2 والخلايا HT29MTX إلى حاوية معقمة مملوءة مسبقا بوسط زراعة الخلايا التكميلي. استنشق الوسط المحتضن مسبقا من الجانب القمي للغرفة المعدة مسبقا.

امزج تعليق الخلية برفق عن طريق سحب العينة ، وانقل 1.5 مل إلى الحجرة القمية لإدخالات الغرفة ، وخلط تعليق الخلية كل واحد إلى ثلاثة آبار لضمان التجانس المستمر. حرك الألواح برفق ذهابا وإيابا ثم من اليمين إلى اليسار لتوزيع الخلايا بالتساوي في البئر. انقل الألواح إلى الحاضنة ، وكرر حركة الألواح.

يجب أن يتم جلوس الخلايا مع التجانس المستمر لتعليق الخلية لضمان انتشار متساو في البئر. لقياس سلامة الحاجز الظهاري قبل بدء ASA ، تأكد من شحن معدات الطبقة بالكامل قبل بدء القياسات. افصل معدات الطبقة عن مصدر الطاقة ، وقم بتغطيتها بكيس أوتوكلاف بلاستيكي.

قم بعمل ثقب في الكيس لإدخال القطب الكهربائي في منفذ الإدخال على العداد. ثم رش الكيس بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل نقل معدات الطبقة إلى خزانة التدفق. لتطهير القطب ، اغمر أطراف القطب في 70٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة.

اترك الأطراف تجف في الهواء لمدة 15 ثانية ، ثم استخدم وسط زراعة الخلايا لشطف القطب. اسمح للخلايا بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة داخل خزانة التدفق. تأكد من فصل العداد عن الشاحن ، ثم اضبط مفتاح الوضع على أوم ، وقم بتشغيل مفتاح الطاقة.

قم بقياس مقاومة الخلية عن طريق غمر القطب الكهربائي بالطرف الأقصر في الملحق والطرف الأطول خارج البئر. احتفظ بالقطب الكهربائي بزاوية 90 درجة على إدراج اللوحة. لمحاكاة الهضم الفموي ، انقل ثلاثة ملليلتر من المجتمع البكتيري في أنبوب معقم سعة 50 مليلتر ، واخلطه مع ثلاثة ملليلتر من سائل اللعاب المحاكي أو SSF.

أضف 75 وحدة لكل مليلتر من ألفا أميليز من اللعاب البشري من النوع 9 أ وجرامين لكل لتر من الميوسين من معدة الخنازير من النوع 2. احتضن الخليط عند 37 درجة مئوية و 100 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. اجمع عينة ملليلتر لاستخراج الحمض النووي وقياس التدفق الخلوي.

لمحاكاة هضم المعدة ، أضف أربعة ملليلتر من سائل المعدة المحاكي أو SGF إلى ثلاثة ملليلتر من البكتيريا. استخدم حمض الهيدروكلوريك المولي لضبط الرقم الهيدروجيني إلى ثلاثة إذا لزم الأمر. احتضان العينة عند 37 درجة مئوية و 100 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين.

ثم جمع عينة ملليلتر. لعملية هضم الأمعاء الدقيقة ، أضف أربعة ملليلتر من السائل المعوي المحاكي أو SIF إلى البكتيريا. استخدم هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة الحموضة إذا لزم الأمر.

ثم احتضان العينة عند 37 درجة مئوية و 100 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. وجمع عينة ملليلتر. بعد غسل وضبط كثافة خلايا هضم الأمعاء الدقيقة وفقا لبروتوكول النص ، قم بإزالة الوسط القمي من نظام الترسيب ، وأضف 1.5 مل من المعلق البكتيري.

الزراعة المشتركة للنظام في ظل ظروف زراعة الخلايا العامة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بقياس قيم الطبقة لتقييم سلامة الحاجز الظهاري كما هو موضح سابقا في الفيديو. أضف 0.5 مل من 10 مللي مولار n-acetylcysteine و HPSS لإذابة المخاط الناتج عن HT29MTX واستعادة البكتيريا الملتصقة.

احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة تحت التحريض. استرجع NAC HPSS في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، واستخدم ملليلتر واحد من DPBS لغسل الخلايا مرتين. أضف 0.5 مل من 0.5٪ triton-x100 أعلى الطبقات الأحادية ، وقم بتعطيل الخلايا عن طريق سحب العينات.

ثم استرجع السائل بسرعة في دوامة لمدة دقيقة واحدة. السرعة أمر بالغ الأهمية لتجنب إتلاف الخلايا البكتيرية بالمنظف. قم بتحليل العينات وفقا لبروتوكول النص.

كما ورد هنا ، كانت أعداد الخلايا السليمة من السلالات الفردية حوالي 10 إلى الخلايا الثامنة لكل مليلتر قبل إنشاء المجتمع الاصطناعي بينما احتوى العالم المصغر متعدد الأنواع على أكثر من 90٪ من الخلايا القابلة للحياة أثناء إنشاء المجتمع. بناء على القياس الكمي للحيا ، تنخفض صلاحية البكتيريا بعد كل خطوة هضم نتيجة لدرجة الحموضة الحمضية أثناء مرور المعدة والأملاح الحيوية الموجودة في سوائل هضم الأمعاء الدقيقة. يمكن أن تؤدي الظروف القاسية لهضم المعدة والأمعاء الدقيقة إلى تحويل البكتيريا إلى خلايا قابلة للحياة ولكن ليس في الخلايا القابلة للزراعة وهي بكتيريا حية لا تنمو أو تنقسم.

كما هو موضح في هذا الشكل ، فإن الخلايا القابلة للحياة المستردة من الواجهة المخاطية ملونة باللون الأزرق في مخطط قياس التدفق الخلوي. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي نمو عندما كانت عينات المخاط هذه مطلاء. الجزء الذي تظهر فيه البكتيريا معدلات بقاء أعلى هو الحطام الخلوي كما يتضح من عد الألواح.

قد يكون عدد المستعمرات متغيرا ، ولكن يوجد وجود بكتيريا نشطة في التمثيل الغذائي في العينات الأقل تخفيفا. بعد هذا التطور ، يمكن استخدام هذه التقنية من قبل الباحثين من مجالات علم الجينوم الغذائي أو علم الميكروبات الدوائية لدراسة المضيف بشكل مجهري. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن إجراء تقنيات أخرى مثل النسخ أو تحليل التمثيل الغذائي للحصول على فهم ميكانيكي في عملية الاستعمار الناجحة وفقا لذلك.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نموذج معقد في المختبر ممثل لعمليات الهضم بما في ذلك الحديث المتبادل بين الخلايا المضيفة وبقية الميكروبيوم. لا تنس أن العمل مع البكتيريا المسببة للأمراض يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ومن المهم مراعاة احتياطات السلامة الحيوية.