السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الغدد الصماء ، وكذلك مجال علم الأعصاب ، مثل بحثنا لمراجعة استجابات الأدمغة لإشارات الغدد الصماء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكنك فحص التأثيرات المباشرة لإشارات الغدد الصماء على الدماغ المنفصل عن الأنسجة الأخرى. لبدء هذا الإجراء ، استخدم الملقط لخدش المركز السفلي لطبق استزراع بلاستيكي لإحداث انبعاج لتسهيل تركيب العقدة البطنية لدماغ اليرقات بعد التشريح.

باستخدام عود أسنان ، ضع قطرة صغيرة من الغراء الفائق على جانبي الانبعاج ، وقم بتوصيل قضيب التنغستن بالغراء. بعد ذلك ، باستخدام قطعة صغيرة من المادة اللاصقة القابلة لإعادة الاستخدام تشبه المعجون ، قم بعمل جدار دائري يحيط بالانبعاج. لتشريح دماغ اليرقات ، بعد 90 إلى 120 ساعة من وضع البيض ، اجمع اليرقات واغسلها ثلاث مرات على الأقل بالماء المقطر لإزالة بقايا الطعام الملتصقة.

بعد ذلك ، ضع يرقة على كوب ساعة مربع بحجم بوصة ونصف مملوء ب PBS المثلج. استخدم زوجا من الملقط للاستيلاء برفق على الجزء الأوسط من اليرقة. استخدم زوجا آخر من الملقط للإمساك بخطافات الفم وسحبها برفق لفصل الجزء الأمامي من اليرقة التي تحتوي على الدماغ عن بقية الجسم.

ثم أمسك الطرف الأمامي بالملقط واقلب اليرقة من الداخل إلى الخارج. قم بإزالة الأنسجة الدخيلة المرتبطة بالدماغ ، مثل الأقراص الخيالية والأجسام الدهنية والغدة الحلقية. افصل الدماغ برفق عن أجزاء الفم.

بعد ذلك ، ضع 200 ميكرولتر من PBS على الجزء الداخلي من الحلقة اللاصقة المعدة مسبقا في غرفة التصوير. امتصاص الدماغ المقطوع برفق باستخدام PBS في ماصة باستور ، وانقله إلى غرفة التصوير. في غرفة التصوير، أمسك ألياف العضلات الممتدة من العقد البطنية وأدخل الدماغ برفق في الانبعاج الموجود أسفل سلك التنغستن.

بعد ذلك ، اسحب سلك التنغستن لأعلى قليلا لوضع الدماغ في الموضع الصحيح للتصوير. للحصول على صور مضان الكالسيوم ، ضع غرفة التصوير التي تحتوي على نبتة الدماغ تحت المجهر. اخفض العدسة الموضوعية حتى تلامس PBS ، وتحت إضاءة المجال الساطع ضع الدماغ وجعله في نطاق التركيز.

قم بالتبديل إلى ضوء الفلورسنت واضبط التركيز على الخلايا المسماة بنجاح GCaMP. ابدأ الاستحواذ بسرعة 250 مللي ثانية / إطار ، بدقة 512 × 512 بكسل في وضع تبريد الماء. بعد ذلك ، اضبط وقت التعرض للحصول على قيم التألق ضمن النطاق الديناميكي لكاميرا CCD ، ولكن ليس أقل من 1000 وحدة عشوائية مع صور 16 بت.

بمجرد تحديد معلمات التصوير ، التقط الصور لمدة دقيقة واحدة قبل إعطاء الببتيد للكشف عن شدة إشارة خط الأساس. بعد ذلك ، قم بتطبيق ببتيد الاختبار مباشرة ، عن طريق سحب 100 ميكرولتر من محلول الببتيد المحضر في حمام اليرقات. سجل انبعاث نجاح GCaMP لبضع دقائق.

لتحليل البيانات ، افتح برنامج التحليل واستخدم الإطار الأول الذي كان قبل تطبيق الببتيد كصورة مرجعية. ثم حدد الإضافات ، TurboReg. اختر ملف الصورة التسلسلية كالمصدر، والصورة المرجعية كهدف.

بعد ذلك ، تحقق من Rigid Body و Accurate لمعرفة طريقة المعالجة والجودة ، على التوالي. بعد ذلك ، انقر فوق دفعة لبدء معالجة الصور. حدد مناطق متعددة ذات اهتمام باستخدام التحليل والأدوات ومدير العائد على الاستثمار في علبة الصور.

بعد ذلك ، قم بقياس شدة البكسل بالنقر فوق المزيد ، القياس المتعدد ، موافق ، في نافذة مدير عائد الاستثمار. في هذه التجربة ، تعرض الدماغ من النوع البري ل CCHa2 و Ghrelin و Nociceptin ، بينما تعرض الدماغ المتحور لمستقبلات CCHa2 ل CCHa2. تم الكشف عن إشارات GCaMP6 في الخلايا المنتجة للأنسولين عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر بسرعة 250 مللي ثانية / إطار ، وإليك الصور الثابتة لنقاط زمنية محددة.

تم رسم نسبة التغير في شدة عائد الاستثمار إلى شدة إشارة خط الأساس في كل نقطة زمنية. حيث يتم تعيين عائد الاستثمار على أجسام الخلايا التي تم اكتشافها في نفس المستوى البؤري. تشير الخطوط الصلبة إلى متوسط خمس إلى 10 عينات ، وتشير الخطوط المنقطة إلى الحدود العليا والدنيا للخطأ المعياري للمتوسط.

تشير المناطق المظللة إلى تباين الإشارات في التجارب. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ساعة واحدة ، إذا تم تشكيلها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحضير عينة الدماغ بسرعة ، لتجنب تلفها.

يمكن دمج هذا الإجراء مع علم الوراثة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل خصوصية المستقبلات. النظام المستخدم في هذا البروتوكول سهل التحضير وقابل لإعادة الاستخدام. وبالتالي ، سيكون هذا البروتوكول مفيدا ، كما هو الحال في الفحص.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الغدد الصماء وعلم الأعصاب لاستكشاف الشبكات الهرمونية التي تتحكم في وظائف المخ في ذبابة الفاكهة.