اتباع نهج موائع جزيئية المستندة إلى الحبرية والتضخيم ميكروسفيري-بكر للحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل أمبليكونس

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تقنية الجمع بين نظام microfluidic ومجال التكنولوجيا الحيوية الجزيئية ، مثل الأجهزة microfluidic وطريقة PCR عدم التماثل. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي التوليد الفعال للميكروسفيرات المتجانسة للغاية وإنتاج الحمض النووي الأحادي دون أي خطوات فصل إضافية. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو التشخيص أو العلاج من الأمراض المختلفة.

لأن توليد الحمض النووي واحد حبلا هو المفتاح لمقايس ap-ta-mo-sis، يمكن استخدامه للكشف والعلاج. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في نظام microfluidic ثلاثي الأبعاد في MEMS ، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى تستخدم للكشف عن الأمراض وعلاجها. عموما، سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال من أجل السيطرة بشكل صحيح السوائل من تدفق في الاتجاه العكسي.

يعد العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة أمرًا بالغ الأهمية لمراقبة تكوين الغلاف الدقيق في هندسة تركيز التدفق وصلابة النطاقات الصغرية المولدة. أولا، إعداد 20 ملليلتر من السائل PDMS قبل البوليمر عن طريق خلط البوليمر قاعدة وحافز في نسبة 10 إلى واحد. صب 10 ملليلتر من PDMS السائل على قالب سو 8 أعدت على رقاقة السيليكون للجزء العلوي من شبكة microfluidic.

للجزء السفلي شقة، صب نفس حجم PDMS السائل على رقاقة السيليكون دون هيكل العفن. ضع ورقتين من رقائق السيليكون مغلفة بـ PDMS السائلة قبل البوليمر على لوحة ساخنة محمّدة مسبقًا واشفي عند درجة حرارة 75 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، تقشير طبقة PDMS المعالجة يدويًا من قالب SU-8.

محاذاة قطر 1.5 ملليمتر جولة ثقب الثقوب أداة اللكم إلى ميناء النفط على شبكة microfluidic المكررة لتواصل قنوات تدفق ميكرون على نطاق مع عينات السائل الكلي. ثم لكمة يدويا من خلال حفرة. بعد تكرار عملية اللكم ثلاث مرات، قم بإجراء المعالجة السطحية المائية على كل من طبقات PDMS العليا والسفلى باستخدام مُعالجة الهالة المحمولة لعدة ثوانٍ لكل عينة.

قم بتكديس طبقتين PDMS المعالجة بالبلازما وسخّنهما عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على لوحة ساخنة لعملية الربط بين PDMS و PDMS. دوامة وطاردة مركزية لفترة وجيزة معيار تقطعت بهم السبل الحمض النووي acrydite المسمى مسبار واحد وحل الأسهم 19 إلى واحد الأكريلاميد مكرر. إعداد حل واحد عن طريق خلط 25 ميكرولترات من 40٪ محلول أكريلاميد مكرر، 10 ميكرولترات من الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل، 10 ميكرولترات من 5X TBE العازلة، وخمسة ميكرولترات من المياه.

إعداد حل اثنين مع 50 ميكرولترات من 20٪ persulfate الأمونيوم. إعداد اثنين من الحقن شغلها بشكل فردي مع الحل واحد والحل الثاني وجبل لهم على مضخة حقنة لإدخال تدفق الحل في منصة microfluidic. إعداد الزيوت المعدنية مختلطة مع 0.4٪ TEMED لتجمد السطح من الغلاف الدقيق.

بعد ملء زجاجة مع الزيوت المعدنية، إدراج اثنين من أنابيب إلى الموانئ الهوائية والسوائل في غطاء زجاجة كخزان microfluidic. توصيل الأنابيب بين الزجاجة وميناء النفط في الجهاز microfluidic. قم بتوصيل الأنابيب بمواني الحل في الجهاز microfluidic من أجل توريد الحلين من مضخات الحقن.

ثم أدخل الأنابيب إلى منفذ المنفذ من أجل نقل الغلاف الدقيق المتولد إلى القارق. بعد ذلك، تعيين معدل تدفق مضخة حقنة إلى 0.4 إلى 0.7 ملليلتر في الساعة. ضبط ضغط الهواء المضغوط من ضاغط باستخدام منظم.

ضع كوب زجاجي مع شريط التحريك المغناطيسي على لوحة ساخنة وحدد السرعة الدورانية. تشغيل مضخة حقنة وتوريد الهواء المضغوط المتولدة عن ضاغط خارجي في زجاجة باستخدام السيطرة على الخروج من صمام الكهرومغناطيسي. باستخدام المجهر الرقمي، مراقبة تشكيل microspheres في هندسة تركيز التدفق وتوطد microspheres ولدت في الكأس الزجاج.

مراقبة تشكيل microspheres هي واحدة من أهم الخطوات لأنها عملية رئيسية في هذه الدراسة لإنتاج microspheres ونظام microfluidic. وبعد ذلك، نقل 100 ميكرولتر من الميكروسفير إلى أنبوب أجهزة طرد مركزي صغيرة 1.5 ملليلتر. ثم إزالة supernatant من خلال الطرد المركزي لطيف و pipetting.

Resuspend المجّانيّة المُعدّلة بالمسبار سيانين-3 باستخدام 100 ميكرولترات من 1X TE العازلة من أجل تحقيق تركيز نهائي من 100 ميكرومولار. بعد ذلك، أضف 100 ميكرومولار من السيانين-3 المعدل بالمسبار التكميلي إلى أنبوب معقمة سعة 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة يحتوي على مجهرية من نوع AP. اضغط على الأنبوب عدة مرات للمزج والاحتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعة واحدة.

بعد الحضانة، والتخلص من افرا وإزالة العازلة المتبقية من خلال الأنابيب. ثم شطف ثلاث مرات مع 500 ميكرولترات من عازلة TE. ضع الميكروسفير على شريحة زجاجية من 75 في 50 ملليمترًا واغطيها برقائق الألومنيوم قبل التصوير.

الحصول على ما يقرب من 25 ميكروسيففير من خلال العد المجهري باستخدام المجهر الخفيفة مع التكبير 40X. بعد ذلك، قم بتجميع جميع الكواشف كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع العينات في دراجة حرارة وابدأ PCR غير المتماثل في ظل الظروف المناسبة.

جمع من فوق بعد PCR غير المتماثلة هي واحدة من الخطوة الأكثر أهمية لأنها عملية رئيسية لتوليد الحمض النووي حبلا واحد مع microsphere. بعد التضخيم، إضافة ثمانية ميكرولترات من 6X تحميل العازلة لكل عينة. تحميل 15 ميكرولترات من كل عينة في 2٪ agarose هلام.

ثم قم بإجراء الكهرباء عند 100 فولت لمدة 35 دقيقة في 1X TAE العازلة. ضع الميكروفوسفيرات المهجّنة في حامل وأرفق الحامل بمرحلة المجهر confocal. حدد الليزر وتشغيله في التحكم بالليزر.

حدد العدسة الهدف في التحكم في المجهر. ثم حدد المرشح المطلوب للسيانين-3 والقناة في عنصر تحكم التكوين. وأخيراً، ابدأ التجربة ولاحظ العينة.

تتكون منصة microfluidic القائمة على الدرمرات المصنعة من طبقتين من طبقات PDMS. وتستخدم ثلاثة أنواع من شبكات القنوات الدقيقة لتوليد الميكروسفيرات الدقيقة، وهي هندسة تركز على التدفق، وقناة ثعبان لخلط الحلول الأولى والأخرى، وقناة البلمرة لتكديس الغلاف الدقيق. واستخدم نظام للتحكم بالهواء المضغوط قائم على المختبر للتدفق المستمر للزيوت المعدنية ومضخات حقنتين لتدفق الحل لتوليد صغرف في منصة ميكروفلويديك.

إذا تم وظيفية مصغرة بشكل صحيح مع مسبار الحمض النووي الاكريديت خمسة رئيس، فإنها ينبغي أن تؤدي إلى تغطية النشاط الفلورسنت على السطح أثناء تجربة التهجين كما هو مبين في هذه الصور الفلورية. وإذا لم يحدث التهاب المغذيات الدقيقة بشكل صحيح، فإن صورة الغلاف المجهري البصرية قد تظهر تلوثاً داخلياً داخل الميكروسفيرات. التلاعب السطح ثلاثي الأبعاد من microspheres مع الحمض النووي oligo التحقيق هو عملية أسرع بكثير ومنصة التوليف على تدفق microsphere يمكن أن توفر أداة لتضخيم الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل وتنقيته.

يوفر AP الخمسة prime في البداية نهاية هيدروكسيل ثلاثية لتمرمرة الحمض النووي بعد التلوي إلى قالبه التكميلي. وقد لوحظت ملوثات الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في تجربة PCR غير المتماثلة. وقد تم إثبات الحمض النووي الوحيد الناتج الذي تقطعت به السبل والمتراكم من البوليمير البوليمير المجهري بالمقارنة مع علامات الحجم الاصطناعية من خلال تحليل الجل الكهربائي.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن المعرفة المسبقة للبروتوكولات والتعديلات التي تكون ضرورية عادة لتحسين تجارب PCR مطلوبة للحصول على دورة التضخيم ودرجة حرارة التلاين وتسلسل التحقيق في هذه الطريقة. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التشخيص والعلاج لربط منطقتين في التكنولوجيا الحيوية الجزيئية والطب الحيوي. لا تنسى أن العمل مع محلول الأكريلاميد يمكن أن يكون خطيرا وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعاطف المختبر دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.