مما يجعل الناجم عن تصريف جسيمات شبيهة بالفيروس سي نيون بالكيمياء ديبروموماليميدي-ثنائي كبريتيد

نقدم هنا، على إجراء فلوريسسينتلي فونكتيوناليزي ديسولفيديس في عزام Qβ مع ديبروموماليميدي. يصف لنا التعبير Qβ وتنقية وتركيب جزيئات فونكتيوناليزيد ديبروموماليميدي ورد فعل الاقتران بين ديبروموماليميدي و Qβ. يمكن استخدام الجسيمات مترافق نيون الصفراء الناتجة كتحقيق الأسفار داخل الخلايا.

الهدف العام من طريقة الاقتران الحيوي هذه هو إضفاء الطابع الوظيفي الفلوري على ثاني كبريتيد يحتوي على جزيئات شبيهة بالفيروسات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تفاعل الاقتران الحيوي للجزيئات الشبيهة بالفيروسات التي تحتوي على عدد محدود من بقايا الأحماض الأمينية التي يمكن تشغيلها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه باستخدام تفاعل واحد يمكن إدخال مجموعات وظيفية جديدة ويمكن تشكيل الفلوروفورات الناجمة عن الاقتران في نفس الوقت.

بالإضافة إلى QBeta ، نعتقد أنه يمكن تطبيق هذا التفاعل على أي جزيئات شبيهة بالفيروسات تمتلك روابط ثاني كبريتيد. قبل البدء في إجراء شفط بكتيريا QBeta ، امسح منطقة المقعد بمحلول مبيض: إيثانول 1: 1. في بيئة معقمة ، اصنع ثقافتين بادئتين بسعة ثلاثة ملليلتر عن طريق إضافة مستعمرات مفردة من الإشريكية القولونية BL21 إلى وسائط SOB.

قم بزراعة الثقافات في غرفة 37 درجة مئوية ورطوبة نسبية 0٪ مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإزالة كل من مزارع البداية سعة ثلاثة ملليلتر من شاكر وفي بيئة معقمة ، اسكب كل ثقافة بداية في قارورة Erlenmeyer محيرة سعة لترين مع لتر واحد من وسائط SOB الجديدة. ضع قارورتي الوسائط الملقحة على شاكر عند 250 دورة في الدقيقة في غرفة الرطوبة النسبية 37 درجة مئوية و 0٪.

قم بزراعة البكتيريا حتى تصل إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر أو OD 600 من 0.9 إلى 1.0. يستغرق هذا عادة حوالي خمس ساعات. عندما تكون المزارع في OD 600 المطلوب ، استخدم ماصة P1000 لإضافة مليلتر واحد من IPTG أحادي المولار إلى كل قارورة للحث على التعبير عن البروتين.

اترك القوارير على الخلاط في الغرفة الدافئة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة القوارير من شاكر ، وانقل محتويات كل قارورة إلى زجاجة سعة لتر واحد ، وجهاز الطرد المركزي عند 20،621 ضعف الجاذبية عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة لحصاد الخلايا. عند الانتهاء من الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية عن طريق سكبها في قارورة بها حوالي خمسة ملليلتر من المبيض لقتل البكتيريا.

لجمع حبيبات الخلية, استخدم ملعقة لكشط حبيبات الخلية من قاع زجاجة الطرد المركزي ونقل الحبيبات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. لبدء إجراء تنقية QBeta ، أعد تعليق كل حبيبات خلية ب 20 إلى 30 مل من محلول فوسفات البوتاسيوم 0.1 مولار ، الرقم الهيدروجيني 7. تأكد من عدم وجود أجزاء من إعادة التعليق.

قم بتحليل الخلايا باستخدام معالج الموائع الدقيقة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قم بعمل لحالة الخلايا مرتين على الأقل لزيادة إنتاجية الجسيمات. انقل المحللات إلى زجاجات طرد مركزي سعة 250 مليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 20،621 ضعف الجاذبية عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

قياس حجم المادة الطافية بالملليلتر. اضرب هذه القيمة في 0.265 ثم أضف إلى المادة الطافية هذه الكمية بالجرام من كبريتات الأمونيوم. يضاف شريط التحريك ويقلب على طبق التحريك عند 200 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة على الأقل لترسيب البروتين.

أجهزة الطرد المركزي في زجاجات سعة 250 مليلتر عند 20،621 ضعف الجاذبية عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات بحوالي 40 مل من محلول فوسفات البوتاسيوم 0.1 مولار, الرقم الهيدروجيني 7. أضف إلى العينة الخام كميات متساوية من الكلوروفورم 1: 1: n-Butanol واخلطها عن طريق الدوامة لبضع ثوان.

انقل الخليط إلى أنبوب سعة 38 مل. جهاز الطرد المركزي عند 20 ، 621 ضعف الجاذبية عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. استخدم ماصة لاستعادة الطبقة المائية العلوية.

كن حذرا حتى لا تأخذ أيا من الطبقة الشبيهة بالهلام التي تشكلت بين الطبقات المائية والعضوية. بعد ذلك ، قم بإذابة ستة تدرجات سكروز مسبقة الصنع من 5 إلى 40٪. قم بتحميل حوالي ملليلترين من المستخلص على كل تدرج.

جهاز طرد مركزي فائق عند 99 ، 582 ضعف الجاذبية عند أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة مع تباطؤ حر. عند اكتمال الطرد المركزي الفائق ، قم بتسليط ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء أسفل كل أنبوب للتأكد من أن النطاق الأزرق مرئي. استخدم حقنة إبرة طويلة لاستعادة هذه الجسيمات.

حبيبات فائقة للجسيمات عند 370 ، 541 ضعف الجاذبية عند أربع درجات مئوية لمدة 2.5 ساعة. يجب أن تكون الحبيبات الناتجة من الجسيمات المنقاة شفافة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات باستخدام محلول فوسفات البوتاسيوم 0.1 مولار, الرقم الهيدروجيني 7.

يوضح هذا التخطيطي الاقتران الذي سيتم إظهاره. يتم استخدام 10 مكافئات من Tris (2-carboxyethyl) phosphine أو TCEP بالنسبة لثاني كبريتيدها في ملليغرام واحد من QBeta لتقليل جميع ثاني كبريتيدها لتوليد قفيصة QBeta المخفضة في درجة حرارة الغرفة في ساعة واحدة. قبل تقليل ثاني كبريتيد على QBeta مباشرة ، قم بإعداد محلول TCEP جديد.

قم بإذابة 0.002 جرام من TCEP ومليلتر واحد من الماء فائق النقاء لعمل محلول مخزون 100X. أضف 200 ميكرولتر من خمسة ملليغرام لكل مليلتر QBeta في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثم أضف 20 ميكرولترا من محلول مخزون 100X TCEP إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. في غضون ذلك ، قم بإعداد محلول ثنائي بروموماليميد بولي إيثيلين جلايكول أو DB-PEG للتفاعل اللاحق لإعادة سد ثاني كبريتيدات المختزلة. قم بإذابة 0.0017 جرام من DB-PEG في 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل فورماميد.

أضف 680 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم 10 مللي مولار ، الرقم الهيدروجيني 5. بعد ذلك ، أضف QBeta المخفضة إلى محلول DB-PEG وراقب عملية الخلط تحت مصباح UV محمول باليد 365 نانومتر. عند الخلط ، يجب أن يكون الفلورسين الأصفر الفاتح مرئيا على الفور.

دع التفاعل يستمر في درجة حرارة الغرفة على المشواة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، قم بتنقية خليط التفاعل بواسطة مرشح الطرد المركزي باستخدام 1X PBS عند 3 ، 283 ضعف الجاذبية عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. أخيرا ، راقب الاقتران عن طريق الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد SDS غير المختزل والرحلان الكهربائي الأصلي لهلام الاغاروز.

تم تأكيد اقتران DB-PEG على QBeta عن طريق الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد SDS غير المختزل تحت الأشعة فوق البنفسجية وتلوين Coomassie الأزرق. جميع أشرطة الفلورسنت موضعية مع تلطيخ Coomassie الأزرق ، مما يمثل اقتران ناجحا. تم تأكيد سلامة مترافقات QBeta-PEG من خلال الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز الأصلي والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال.

يظهر الرسم المجهري العلوي QBeta-maleimide أو QBeta-M ويظهر الرسم المجهري السفلي QBeta-PEG. أظهر التحليل الطيفي الفلوري ل QBeta-M و QBeta-PEG في 0.1 مولار من المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم إثارة قصوى حوالي 400 نانومتر وحد أقصى للانبعاث حوالي 540 إلى 550 نانومتر. عندما تم تحضين QBeta-PEG بخلايا البلاعم الفئرانية في وسط DMEM الخالي من المصل متبوعا بالتلوين النووي ، تظهر صور التوطين المشترك أن جزيئات الفلورسنت الصفراء قد امتصتها الخلايا ويمكن تتبعها بعد أربع ساعات من الحضانة.

في المقابل ، تظهر الجسيمات الشبيهة بفيروس QBeta غير الوظيفية فلورسينزا ضئيلا. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين على تنقية QBeta في أربعة أيام وإجراء تفاعل الاقتران لإعادة التجسير بين عشية وضحاها. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تفاعل الاقتران يعمل بشكل أفضل في ظل الظروف الحمضية ، مثل درجة الحموضة 5.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية QBeta VLP وإعادة ربط روابط ثاني كبريتيد بمركبات ثنائي البروم ماليميد لصنع VLP المسمى بالفلورسنت. بعد تطويرها ، زودت هذه التقنية الباحثين بمقبض وظيفي إضافي يمكن استخدامه لإضفاء الوظيفة المزدوجة على السطح الخارجي للعاثية QBeta.