مما يجعل الناجم عن تصريف جسيمات شبيهة بالفيروس سي نيون بالكيمياء ديبروموماليميدي-ثنائي كبريتيد

الهدف العام من طريقة الاقتران الحيوي هذه هو الوظائف الفلورية للجسيمات الشبيهة بالفيروسات التي تحتوي على روابط ثنائية الكبريتيد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في تفاعل الاقتران الحيوي للجسيمات الشبيهة بالفيروسات التي تمتلك عدداً محدوداً من بقايا الأحماض الأمينية التي يمكن إضفاء وظائف عليها. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه يمكن، من خلال تفاعل واحد، إدخال مجموعات وظيفية جديدة وتكوين حاملات فلورية مستحثة بالاقتران في الوقت ذاته. وبالإضافة إلى Q-Beta، نعتقد أن هذا التفاعل يمكن تطبيقه على أي جسيمات شبيهة بالفيروسات تمتلك روابط ثنائية الكبريتيد.

قبل البدء في إجراء تعبير العاثية Q-Beta، قم بمسح منطقة سطح العمل بمحلول من المبيض والإيثانول بنسبة 1:1. وفي بيئة معقمة، قم بإعداد مزرعتين بادئتين بحجم 3 mL عن طريق إضافة مستعمرات مفردة من E.coli BL21 إلى وسط SOB. قم بتنمية المزارع في غرفة درجة حرارتها 37 °C ورطوبة نسبية 0% مع الرج بسرعة 250 rpm طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بإزالة المزرعتين البادئتين بحجم 3 mL من جهاز الرج، وفي بيئة معقمة صب كل مزرعة بادئة في دورق إرلنماير محجز بحجم 2 L يحتوي على 1 L من وسط SOB طازج. ضع الدورقين اللذين يحتويان على الأوساط الملقحة على جهاز رج بسرعة 250 rpm في الغرفة ذات درجة الحرارة 37 °C والرطوبة النسبية 0%. استمر في تنمية البكتيريا حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر أو OD 600 إلى قيمة تتراوح بين 0.9 و 1.0، وعادة ما يستغرق ذلك حوالي خمس ساعات. وعندما تصل المزارع إلى قيمة OD 600 المطلوبة، استخدم ماصة P1000 لإضافة 1 mL من IPTG بتركيز 1 M إلى كل دورق لتحفيز التعبير البروتيني. اترك الدوارق على جهاز الرج في الغرفة الدافئة طوال الليل.

في صباح اليوم التالي، أخرج الدوارق من جهاز الرج، وانقل محتويات كل دورق إلى زجاجة سعة لتر واحد، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 20,621 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة لحصاد الخلايا. عند انتهاء عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي عن طريق صبه في دورق يحتوي على حوالي 5 mL من المبيض لقتل البكتيريا.

لجمع راسب الخلايا، استخدم ملعقة مختبرية لكشط راسب الخلايا من قاع زجاجة جهاز الطرد المركزي وانقل الراسب إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50-milliliter.

لبدء إجراء تنقية Q-Beta، أعد تعليق كل كتلة خلوية في 20 إلى 30 ملليلتر من محلول منظم فوسفات البوتاسيوم بتركيز 0.1 مولار، pH 7. تأكد من أن التعليق لا يحتوي على أي تكتلات. قم بتحليل الخلايا باستخدام معالج الموائع الدقيقة (microfluidizer) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. كرر عملية تحليل الخلايا مرتين على الأقل لزيادة حصيلة الجسيمات. انقل نواتج التحليل إلى زجاجات طرد مركزي سعة 250 ملليلتر، ثم قم بالطرد المركزي عند 20,621 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة. قم بقياس حجم الراشح بالملليلتر. اضرب هذه القيمة في 0.265، ثم أضف إلى الراشح هذه الكمية بالغرامات من كبريتات الأمونيوم. أضف قضيب تحريك وقم بالتقليب على لوحة تحريك بسرعة 200 rpm عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة على الأقل لترسيب البروتين. قم بالطرد المركزي في زجاجات سعة 250 ملليلتر عند 20,621 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة. تخلص من الراشح وأعد تعليق الكتلة في حوالي 40 ملليلتر من محلول منظم فوسفات البوتاسيوم بتركيز 0.1 مولار، pH 7. أضف إلى العينة الخام أحجامًا متساوية من خليط الكلوروفورم: n-Butanol بنسبة 1:1 واخلطها باستخدام جهاز الفورتكس (vortexing) لبضع ثوانٍ. انقل الخليط إلى أنبوب سعة 38 ملليلتر. قم بالطرد المركزي عند 20,621 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة. استخدم ماصة لاستعادة الطبقة المائية العلوية. كن حذرًا لتجنب سحب أي جزء من الطبقة الهلامية التي تكونت بين الطبقتين المائية والعضوية.

بعد ذلك، قم بإذابة 65 إلى 40% من تدرجات السكروز المُعدة مسبقاً. ثم ضع حوالي 2 mL من المستخلص فوق كل تدرج.

استخدم جهاز الطرد المركزي الفائق عند 99,582 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة 16 ساعة مع تباطؤ حر. عند اكتمال عملية الطرد المركزي الفائق، سلط ضوء صمام ثنائي باعث للضوء (LED) تحت كل أنبوب للتأكد من رؤية حزمة زرقاء. استخدم حقنة ذات إبرة طويلة لاستعادة هذه الجسيمات. قم بترسيب الجسيمات بواسطة الطرد المركزي الفائق عند 370,541 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة 2.5 ساعة. يجب أن تكون الرواسب الناتجة من الجسيمات المنقاة شفافة. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الرواسب باستخدام محلول potassium phosphate buffer بتركيز 0.1-molar وبقيمة pH 7.

يوضح هذا المخطط عملية الاقتران التي سيتم استعراضها. يُستخدم 10 مكافئات من Tris(2-carboxyethyl)phosphine أو TCEP بالنسبة للروابط ثنائية الكبريتيد الموجودة في ملغ واحد من Q-Beta لاختزال جميع الروابط ثنائية الكبريتيد لتوليد كابسيدات Q-Beta المختزلة في درجة حرارة الغرفة خلال ساعة واحدة. قم بتحضير محلول TCEP طازج قبيل البدء في اختزال الروابط ثنائية الكبريتيد في Q-Beta مباشرة.

أذِب 0.002 جرام من TCEP في واحد ملليلتر من الماء عالي النقاوة لتحضير محلول مخزون بتركيز 100X. أضف 200 ميكرولتر من Q-Beta بتركيز خمسة مليجرام لكل ملليلتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. بعد ذلك، أضف 20 ميكرولتر من محلول TCEP المخزون بتركيز 100X إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. تُحضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

وفي هذه الأثناء، قم بتحضير محلول ثنائي برومو-ماليميد بولي إيثيلين جليكول أو DB-PEG لاستخدامه لاحقاً في تفاعل إعادة ربط ثنائي الكبريتيدات المختزلة. أذب 0.0017 grams من DB-PEG في 100 µL من ثنائي ميثيل فورماميد. أضف 680 µL من محلول فوسفات الصوديوم بتركيز 10 mM، عند pH 5. بعد ذلك، أضف Q-Beta المختزلة إلى محلول DB-PEG وراقب عملية الخلط باستخدام مصباح UV يدوي بطول موجي 365 nm. عند الخلط، يجب أن يظهر فوراً تآلق أصفر ساطع. اترك التفاعل يستمر في درجة حرارة الغرفة على جهاز تدوير (rotisserie) طوال الليل.

في صباح اليوم التالي، قم بتنقية خليط التفاعل باستخدام مرشح طرد مركزي باستخدام 1X PBS عند 3,283 ×g ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. وأخيراً، راقب عملية الاقتران عن طريق الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد SDS غير المختزل والفصل الكهربائي لهلام الأغاروز الأصلي.

تم تأكيد اقتران DB-PEG على Q-Beta عن طريق الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد SDS غير المختزل تحت الأشعة فوق البنفسجية وبصبغة Coomassie blue. وقد تزامنت جميع النطاقات الفلورية مع صبغة Coomassie blue، مما يشير إلى نجاح عملية الاقتران. كما تم تأكيد سلامة مقترنات Q-Beta-PEG عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الأجاروز الأصلي والمجهر الإلكتروني النافذ.

تظهر الصورة المجهرية العلوية Q-Beta-maleimide أو Q-Beta-M، بينما تظهر الصورة المجهرية السفلية Q-Beta-PEG. وأظهر مطياف الفلورة لـ Q-Beta-M و Q-Beta-PEG في محلول منظم من فوسفات البوتاسيوم بتركيز 0.1 molar أن الحد الأقصى للإثارة كان عند حوالي 400 nanometers والحد الأقصى للانبعاث كان بين 540 إلى 550 nanometers. وعند تحضين Q-Beta-PEG مع خلايا البلعوميات الفأرية في وسط DMEM خالي من المصل متبوعاً بصبغ النواة، أظهرت صور التوضع المشترك أن الجزيئات الفلورية الصفراء قد امتصتها الخلايا ويمكن تتبعها بعد أربع ساعات من التحضين.

في المقابل، تظهر الجسيمات الشبيهة بالفيروس Q-Beta غير الوظيفية وميضاً ضئيلاً.

يمكن لهذا البروتوكول أن يساعد الباحثين في تنقية Q-Beta خلال أربعة أيام وإجراء تفاعل الاقتران بإعادة التجسير طوال الليل. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن تفاعل الاقتران يعمل بشكل أفضل في الظروف الحمضية، مثل pH 5.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تنقية VLP الخاصة بـ Q-Beta وإعادة ربط روابط ثنائي الكبريتيد باستخدام مركبات dibromo-maleimide لصنع VLP موسومة فلوروسنتياً. بعد تطوير هذه التقنية، وفرت للباحثين مقبضاً وظيفياً إضافياً يمكن استخدامه لإضفاء وظائف مزدوجة على السطح الخارجي لبكتيريو فاج Q-Beta.