تحليل الجريان خارج الخلية عزل وتوصيف وإنتاجية عالية للماوس الأساسي كلوي أنبوبي الخلايا الظهارية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول التمثيل الغذائي الكلوي ، مثل أكسدة الأحماض الدهنية ، والتي ترتبط ارتباطا وثيقا بتطور التليف الكلوي والعديد من اعتلالات الكلية الأخرى. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام منصة عالية الإنتاجية للكشف عن المركبات التي تنظم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج أمراض التمثيل الغذائي الكلوي لأنها تسمح بفحص عالي المركبات التي تنظم عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا في الخلايا الظهارية الكلوية.

لتحضير أطباق بتري المغلفة بالكولاجين مقاس 60 ملم ، أضف ملليلترين من حمض الأسيتيك 20 مليمولار المصفى مسبقا متبوعا ب 35 ميكرولترا من محلول الكولاجين الأول لكل طبق. ثم قم باحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ، وجففها بالهواء ، وعرضها للأشعة فوق البنفسجية. بعد ذلك ، اشطف بقايا حمض الأسيتيك باستخدام PBS. قم بثلاث شطف.

بعد ذلك ، قم بتخزين الطبق في حاضنة زراعة الخلايا الخالية من ثاني أكسيد الكربون بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد تحضير الفأر للجراحة ، قم بإزالة الفراء من الصدر والبطن باستخدام كريم مزيل الشعر. ثم قم بتطهير الجلد باليود ، وامسح بقايا اليود.

بعد ذلك ، قم بعمل شق لفتح تجويف البطن ، وفضح القلب والكلى. الآن ، قم بإعداد مضخة التروية بسرعة 32 مل في الدقيقة ، وقم بإزالة أي فقاعات في الأنبوب قبل بدء التروية. استخدم إبرة قياس 27 في نهاية الخط.

للمتابعة ، أدخل إبرة في البطين الأيسر من خلال قمة القلب. بمجرد أن يملأ المخزن المؤقت القلب ، قم بعمل ثقب في الأذين الأيمن لإنشاء مخرج للمخزن المؤقت للتروية. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى المخزن المؤقت للهضم ، وقلل سرعة المضخة قليلا إلى 30 مل في الدقيقة للهضم.

20 مل من المخزن المؤقت للهضم ، قم بإزالة كلتا الكليتين لعزل الخلايا الأنبوبية. لمعالجة الكلى المحصودة ، قم أولا بإزالة الكبسولات الكلوية والنخاع. بعد ذلك ، افرم كلتا الكليتين إلى قطع صغيرة ، واحتضنهما في 10 مل من عازلة الهضم في فرن 37 درجة مئوية مع دوران لطيف لمدة خمس دقائق.

بعد الهضم ، قم بإزالة أي أنسجة غير مهضومة عن طريق تمرير المخزن المؤقت عبر مرشح 70 ميكرون. بعد جمع الأنسجة المهضومة ، أضف 10 مل من وسائط الثقافة لوقف الهضم. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الأنسجة المفلترة عند 50 جم لمدة خمس دقائق لتكسير الخلايا الأنبوبية.

بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، وأضف خمسة ملليلتر من وسائط الثقافة ، وكرر الطرد المركزي لجمع أي خلايا أنبوبية متبقية. الآن ، قم بإعادة تعليق الحبيبات الأولى في 20 مل من وسائط الاستزراع ، وقم بطردها عند 50 جم لمدة خمس دقائق لتنقية الخلايا المجمعة. تخلص من المادة الطافية.

ثم أعد تعليق كلتا الكريات في 10 ملليلتر من وسط الاستزراع. بعد ذلك ، عد الخلايا الحية باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق. بعد ذلك ، قم بزرع ما يصل إلى 10 ملايين خلية في طبق مغطى بالكولاجين مقاس 60 ملم ، واترك الخلايا الأنبوبية تلتصق طوال الليل.

للبدء ، قم بزرع الخلايا الأنبوبية P1 في 40،000 خلية في آبار صفيحة دقيقة معدة حديثا مكونة من 96 بئرا ومغطاة بالكولاجين. استخدم 100 ميكرولتر من وسائط الاستزراع لكل بئر. يعد تحسين كثافة الخلايا وتركيز المركب في مقايسة التدفق خارج الخلية أمرا أساسيا لتجربة ناجحة.

نوصي بتجربة معايرة بالتحليل الحجمي التجريبية لتحديد كثافة الخلايا المثلى وتركيز المركب. بعد ذلك ، قم بترطيب خرطوشة المستشعر. أولا ، ارفع خرطوشة المستشعر ، واملأ كل بئر من اللوحة ب 200 ميكرولتر من محلول المعايرة.

بعد ذلك ، أعد وضع الخرطوشة لغمر المستشعرات ، واحتضان المجموعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، استنشق الوسائط القديمة واستبدلها ب 175 ميكرولتر من وسائط فحص الجلوكوز أو الأحماض الدهنية. ثم استمر في الحضانة لمدة ساعة بدون ثاني أكسيد الكربون.

أثناء حضانة الخلية ، قم بتحميل المنفذ A للخرطوشة مع 25 ميكرولتر من oligomycin ، ومنفذ التحميل B مع FCCP ، ومنفذ التحميل C مع rotenone / antimycin A ، ومنفذ التحميل D وجميع المنافذ الأخرى بالماء. الآن ، قم بتخزين الخرطوشة في الحاضنة الخالية من ثاني أكسيد الكربون حتى يصبح الإعداد جاهزا للمعايرة. تابع عن طريق تشغيل محلل التدفق خارج الخلية ووحدة التحكم.

بعد ذلك ، افتح برنامج المحلل ، واختر اختبارا قياسيا ، واضغط على خيار معالج الفحص. ثم ، ضمن علامة التبويب "المركبات" ، قم بتعيين المركبات إلى المنافذ المناسبة. ضمن علامة التبويب تصحيح الخلفية ، حدد الآبار التي لا تحتوي على خلايا.

بعد ذلك، استخدم علامة التبويب المجموعات والتسميات لتسمية المجموعات التجريبية. بعد ذلك، ضمن علامة التبويب البروتوكول، قم بتعيين دورات المزيج والقياس المناسبة باستخدام الأوامر المتاحة. يشار إلى هذه الإعدادات في بروتوكول النص ، وبمجرد إدخالها ، احفظ القالب لاستخدامه في المستقبل.

الآن ، اضغط على إنهاء المعالج للمتابعة. الآن ، اضغط على ابدأ لبدء المعايرة. يقوم المحلل بعد ذلك بإخراج حامل اللوحة ويطالب بإدخال لوحة الخرطوشة.

تستغرق عملية المعايرة هذه من 20 إلى 25 دقيقة حتى تكتمل. بمجرد معايرة النظام، اضغط على الأمر الموجه لاستبدال لوحة المعايرة بلوحة الخلية، وتابع التشغيل. عند اكتمال التشغيل ، احفظ بيانات التعرف الضوئي على الحروف ، وقم بإزالة اللوحة من المحلل.

الآن ، أضف Hoechst إلى كل بئر من بئر الفحص ، واحتضن اللوحة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بحساب الخلايا باستخدام إثارة 355 نانومتر وانبعاث 460 نانومتر ، وقم بتطبيع بيانات التعرف الضوئي على الحروف إلى عدد الخلايا. في هذا البروتوكول ، تم زراعة مجموعة غير متجانسة من خلايا الكلى ، والأنابيب المهضومة بشكل غير كامل ، وبقايا الأنسجة الأخرى على ألواح مغلفة بالكولاجين.

في اليوم التالي للعزل ، تم طرد وسائط الاستزراع لإزالة الحطام ، وتم إعادة طلاء الخلايا الأنبوبية. بعد ذلك ، ارتبطت الخلايا بسهولة أكبر ، وبحلول اليوم الخامس في الثقافة ، كانت عند التقاء 80 إلى 90٪. ثم تم زراعة الخلايا الكهربية الكلوية بشكل فرعي ونمت إلى التقاء في غضون أسبوع واحد.

حدث نمو مماثل خلال المقطعين التاليين. اتخذت الطبقة الأحادية من الخلايا تشكيل قبة ، ورفعت اللوحة وظلت متصلة بتقاطعات ضيقة. تم قياس تنفس الميتوكوندريا ل TECs الأولية المعزولة باستخدام تحليل التدفق خارج الخلية الموصوف ل OCR بكثافات طلاء مختلفة كما هو موضح.

كان للخلايا المطلية بكثافات أكبر زيادات متناسبة في التعرف الضوئي على الحروف. غطت 40،000 خلية لكل بئر سطح اللوحة بشكل أفضل من أي كثافات طلاء أخرى ، مما يجعلها التركيز الأمثل لاختبار التفاعلات بين الخلايا والمركبات. على سبيل المثال ، تم تطبيق الوسائط التي تحتوي على ركيزة الأحماض الدهنية على TECs جنبا إلى جنب مع 2DG ، وهو مثبط لتحلل السكر ، لتقييم أكسدة الأحماض الدهنية بشكل مباشر في TECs في المقطعين الأول والثاني.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم دائما الاحتفاظ بسجل للأحجام والتركيزات الدقيقة في كل بئر. يمكن أن تتسبب التعديلات في التركيزات النهائية للمكونات في فشل التجربة بأكملها. بعد تطويرها ، ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض الكلى لاستكشاف دور استقلاب الأحماض الدهنية الأنبوبية في التسبب في اعتلال الكلية المختلفة.