2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

يمكن استخدام هذه الطريقة ليس فقط لمعالجة الأسئلة الرئيسية في البحث الأساسي ، ولكن أيضا للمساهمة في المجالات الطبية والصيدلانية والتكنولوجيا الحيوية ، من خلال تحديد روابط جزيئية صغيرة جديدة للبروتينات الأساسية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح التحليل الموازي للبروتين والشركاء الأيضيين للبروتين المفضل في ظروف الجسم الحي الوثيقة. تساعد هذه الطريقة على صيد الجزيئات المتفاعلة دون أن تقتصر على الروابط المحددة مسبقا.

على الرغم من أن هذه الطريقة تم تطويرها للنباتات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل خلايا HeLa و E.coli و S.Cerevisiae. للبدء ، قم بإعداد وسيط MSMO واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.7 باستخدام هيدروكسيد بوتاسيوم مولي واحد. ثم قم بتعقيم المحلول لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية.

أضف المكملات الغذائية إلى الوسط قبل بدء التجربة مباشرة. الآن ، قم بزراعة خلايا PSBL Arabidopsis thaliana المعدلة وراثيا في 50 مل من وسط MSMO في قارورة سعة 100 مل. بعد ذلك ، ضع القارورة على شاكر منصة مدارية وحرك الخلايا برفق عند 130 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية في الضوء.

كل سبعة أيام ، قم بزراعة الخلايا في وسط جديد بمحلول واحد إلى 10. بعد ذلك ، استخدم قمعا زجاجيا بشبكة من النايلون مثبتة على قارورة مخروطية الشكل ، متصلة بمضخة تفريغ لحصاد الخلايا خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي. ثم لف الخلايا المجففة بورق الألمنيوم ، وقم بتجميدها في النيتروجين السائل.

باستخدام مطحنة خلاط مبردة مسبقا ، اضبطها على تردد اهتزازي يبلغ 20 هرتز. قم بتجانس مادة الخلايا النباتية المحصودة والمجمدة إلى مسحوق ناعم لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بتناول ثلاثة جرامات من المسحوق المطحون لكل عينة باستخدام النيتروجين السائل والمعدات المبردة مسبقا لمنعها من الذوبان.

بعد ذلك ، باستخدام ملاط مبرد مسبقا من النيتروجين السائل ، قم بتقطيع المسحوق المطحون بثلاثة ملليلتر من محلول التحلل المثلج البارد حتى يذوب. قسم العينة المذابة على الفور إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة مليلتر. الطرد المركزي للعينات عند 20،817 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي.

أثناء الطرد المركزي للعينة ، قم بتناول 100 ميكرولتر من حبات سيفاروز IgG لكل عينة. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للتحلل ، وأعد تعليق الخرزات عن طريق الدوامة. قم بتدوير الفلاش لمدة ثلاث ثوان عند 2 ، 000 جم ، وتخلص من مخزن التحلل.

أخيرا ، أعد تعليق الخرزات في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل. بعد الطرد المركزي ، انقل ثلاثة ملليلتر من محللة النبات الصافي إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل. أضف الخرزات المتوازنة مسبقا إلى تحلل النبات ، واحتضن الخليط على عجلة دوارة لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية.

انقل الخليط إلى حقنة متصلة بغطاء مغلق على عمود دوران مع مرشح بحجم مسام 35 ميكرومتر يقع أعلى مشعب التفريغ. قم بتمرير المحللة عبر الوحدة عن طريق تشغيل مضخة التفريغ بضغط لطيف لتجنب الإضرار بالخرز. يتم تصريف المحللة غير المنضمة في محطة النفايات الموجودة في القاعدة في المشعب وتبقى مجمعات البروتين ، المرتبطة بالخرز ، على المرشح.

بمجرد إفراغ المحقنة من محللة الخلية ، أضف 10 مل من محلول الغسيل لغسل الخرز. ثم أضف مليلتر من المخزن المؤقت للشطف لتنفيذ خطوة الغسيل الثانية. الآن ، قم بإزالة المحقنة وغطاء قفل الإغراء.

أغلق الغطاء السفلي عند العمود ، وأضف 400 ميكرولتر من مخزن الشطف الذي يحتوي على 50 وحدة من الشكل المحسن لفيروس حفر التبغ ، البروتياز ، إلى الخرز. ضع العمود على شاكر الطاولة ، واضبطه على 1,000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 16 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 50 وحدة إضافية من البروتياز إلى العمود ، واحتضن الخليط على الخلاط كما في الخطوة السابقة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الغطاء السفلي ، واستبدل العمود في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 20 ، 817 جم لمدة دقيقة واحدة لجمع الشطف والمضي قدما في استخراج البروتين والمستقلب. لبدء الاستخراج ، أضف ملليلتر واحد من ثلاثة إلى واحد إلى مذيب ماء الميثانول MTBE إلى الشطف.

اقلب الأنبوب لخلطه مع العينة. بعد ذلك ، أضف 0.4 مل من محلول ماء الميثانول إلى الخليط ، واقلب الأنبوب لخلط العينة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 20 ، 817 جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة للسماح بفصل الطور.

باستخدام ماصة يدوية لمعالجة السوائل سعة ملليلتر واحد، قم بإزالة المرحلة العلوية التي تحتوي على الدهون. ثم أضف 0.2 مل من الميثانول ، واقلب الأنبوب لخلط العينة. جهاز طرد مركزي عند 20 ، 817 جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، وجمع المرحلة القطبية في أنبوب جديد لقياسات المستقلب.

اترك ما يقرب من 50 ميكرولتر من المرحلة القطبية في الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب إزاحة حبيبات البروتين. بعد ذلك ، جفف الأنبوب الذي يحتوي على المرحلة القطبية في مبخر طرد مركزي طوال الليل. جفف أنابيب حبيبات البروتين لمدة 30 إلى 60 دقيقة لتجنب الإفراط في الجفاف.

باستخدام تنقية التقارب بخطوة واحدة ، جنبا إلى جنب مع تفاعلات البروتين والبروتين والبروتين والمستقلب في مزارع خلايا الأرابيدوبسيس المعدل وراثيا ، تم تحديد التفاعلات. تظهر المزارع الخلوية التي تعبر عن NDPK1 تخصيبا كبيرا في فالين ليوسين ، إيزولوسين غلوتامات ، إيزولسين إيزولوسين ، وإيزولوسين فينيل ألانين عند مقارنتها بعينات الناقل الفارغ و NDPK2 و NDPK3. للبحث عن تفاعلات البروتين والبروتين والمستقلب المعروفة ، يتم تمييز 13 بروتينا وأربعة ثنائيات الببتيد مع NDPK1 ، مقابل قاعدة بيانات الغرز.

تظهر الارتباطات الرئيسية بين تقويم العظام APX1 وعائلة نازعة هيدروجين الألدهيد ، وعامل بدء الترجمة ، FBR12 ، مع عامل بدء الترجمة اثنين من الوحدة الفرعية متماثل ألفا. تظهر ثنائيات الببتيدات المحددة عدم وجود شركاء بروتيني تم الإبلاغ عنهم. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أربع ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على برودة العينات والمعدات والكواشف طوال التجربة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الرحلان الحراري المجهري أو مقايسة النشاط من أجل تحديد التفاعل المباشر بين الجزيئات أو استنتاج رابطها على نشاط البروتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل مع العينة أثناء الإجراء بأكمله للحصول على نتائج جديرة بالثقة وتحديد روابط البروتين الذي تختاره.

لا تنس أن العمل مع الميثانول ومحلول MTBE يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل العمل تحت غطاء الدخان ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.