زرع هوموتشرونيك إينتيرنيورون السلائف في أوائل العقول الماوس بعد الولادة

الهدف العام من هذا الإجراء هو حصاد سلائف الخلايا العصبية الداخلية من مناطق دماغية متميزة في صغار الفئران بعد الولادة ، وزرع هذه الخلايا في متلقين متطابقين مع العمر لتقييم كيفية تأثير التغيرات البيئية على مصير الخلايا العصبية الداخلية ونضجها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب التنموي حول كيفية تفاعل البرامج الجينية الجوهرية والإشارات البيئية لنحت مصير الخلايا العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحليل التغيرات في مصير ونضج سلائف الخلايا العصبية الداخلية بعد نقلها بالتبني إلى بيئة دماغية جديدة.

العرض المرئي لخطوات حصاد الخلايا وتطعيمها أمرا بالغ الأهمية لأن الأخطاء الصغيرة في التقنية يمكن أن تؤدي إلى تجارب زرع غير فعالة وغير ناجحة. للبدء ، ضع شفرة حلاقة واحدة من خلال الفص الأمامي الأمامي لدماغ الجرو في يوم ما بعد الولادة ، وشفرات حلاقة إضافية في الفتحات الخلفية مباشرة لشفرة الحلاقة الأولى لتوليد شريحتين بحجم 0.5 ملم. انقل الشرائح المخططة إلى طبق بتري مع السكروز الفقاعي السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي أو sACSF وضع أنسجة المخ المتبقية في طبق بتري مع sACSF على الثلج.

ضع الشرائح تحت مجهر تشريح واستخدم ملقطا لقرص المخطط من نصفي الكرة الأرضية ، ووضع القطع المخططة في أنبوب 50 مليلتر من sACSF على الجليد أثناء حصادها. إذا تم حصاد الدماغ من فأر مراسل الفلورسنت ، فاستخدم الفحص المجهري الفلوري لتمييز إشارة td-tomato المخططة عن إشارة الفلورسنت الأقوى للكرة الشاحبة. لإزالة الحصين ، استخدم الملقط لتقطيع الدماغ على طول خط الوسط ، ووضع نصف الكرة الأرضية تحت السطح الإنسي المجهر التشريح.

استخدم الملقط لإزالة أنسجة المخ البطنية وتحديد الحصين على شكل نقانق الممتد على الوصول الأمامي الخلفي على طول الجانب الظهري والبطيني من القشرة. أدخل أطراف الملقط أمام الحصين الأمامي ، وقم بدفع الملقط للخلف أثناء الضغط على طول الحدود القشرية للحصين لفصل الحصين برفق عن القشرة. ضع الأنسجة المعزولة في أنبوب سعة 50 مليلتر من sACSF على الجليد وكرر حصاد الحصين لنصف الكرة الأرضية المقابل.

ثم ضع الجانب الإنسي للقشرة نصف المقطوعة لأسفل واستخدم الملقط لإزالة معظم الأجزاء الظهرية والبطنية والأمامية والخلفية من القشرة. انقل المربع المتبقي من القشرة الإنسية إلى أنبوب سعة 50 مليلتر من sACSF على الجليد. بعد إزالة الدماغ، قم بتثبيت الجانب البطني للدماغ لأسفل من خلال المخيخ والقشرة الأمامية أو البصيلات الشمية.

باستخدام ملقط منحني ، افصل القشرة الخلفية برفق عن الحصين الأساسي والأنسجة الأخرى في كل نصف كرة الأرضية. وقشر القشرة الظهرية للأمام لكشف الهياكل الأساسية. استخدم الملقط لضغط الحصين في نصف الكرة الأرضية عند خط الوسط ، وإزالة الحصين عن طريق تقشيره بشكل جانبي بعيدا عن الدماغ.

ضع الحصين في أنبوب سعة 50 مل من sACSF على الجليد وحصد الحصين المقابل بنفس الطريقة. بعد ذلك ، اكشط برفق حول حواف المخطط لفكه من الأنسجة المحيطة. اضغط برفق أسفل المخطط لحصاد الأنسجة المخططة.

بعد حصاد القشرة من نصفي الكرة الأرضية ، كما هو موضح سابقا ، انقل المخطط تحت نطاق تشريح الفلورسنت. استخدم ملقط لإزالة أي نسيج كروي شاحب إيجابي للطماطم باللون الأحمر الفاتح من كل مخطط. عندما يتم حصاد جميع الأنسجة ، انقل الأنسجة إلى أنبوب سفلي دائري بحجم خمسة ملليمترات واستبدل sACSF في كل أنبوب تجميع بملليلترين من محلول pronase-sACSF المحضر حديثا لحضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع النقر العرضي.

في نهاية الحضانة ، استبدل بعناية pronase-sACSF بواحد إلى ملليلتر من محلول إعادة التكوين ، وقم بفصل الأنسجة ميكانيكيا بأنابيب باستور المصقولة بالنار. عندما تكون الأنسجة غائمة ولا تظهر قطع الأنسجة ، قم بتصفية محلول الخلية من خلال مرشح 50 ميكرون في أنابيب سفلية مستديرة جديدة سعة خمسة ملليلتر لإزالة أي كتل خلوية قبل فرز الخلايا التي يتم تنشيطها بالفلورة. بعد تلقي الخلايا من قياس التدفق الخلوي ، انقل معلقات الخلية إلى أنابيب مخروطية سعة 1.5 ملليلتر للطرد المركزي.

بعد الطرد المركزي ، قم بشفط كل ما عدا آخر 20 ميكرولترا من المادة الطافية من كل أنبوب ، وأعد تشكيل الكريات للعد. إذا لزم الأمر ، قم بتخفيف محلول الخلية باستخدام sACSF إلى واحد إلى ثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز ميكرولتر. قم بتحميل ماصة دقيقة بالزيت المعدني.

قم بتوصيل الماصة الدقيقة بحاقن نانولتر ، وقم بتأمين جهاز حقن النانو لتر بمناور متصل بقاعدة مغناطيسية. أثناء تخدير الجرو الأول على الجليد ، قم بسحب محلول الخلية عدة مرات لضمان توزيع الخلايا المتجانس. أخرج الزيت المعدني واملأ الماصة بالكامل بتعليق الخلية الواحدة.

بعد التأكد من عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم ، ضع الجرو على غطاء طبق بتري مع وضع الرأس على معجون لاصق ، بحيث يكون الجزء العلوي من الرأس مسطحا نسبيا. قم بتغطية الرأس بقطعة من شريط المختبر بفتحة ماسية ، واسحب الشريط الذي تم تدريسه حتى يتم شد الجلد بحيث يتم تأمين الرأس بإحكام ويكون لامدا مرئيا من خلال الفتحة. حرك الجرو الآمن أسفل حاقن النانولتر وقم بخفض الماصة الدقيقة بحيث يكون الطرف فوق لامدا مباشرة.

راقب إحداثيات X وY على المعالج واضبط مقابض المناور حتى يتم وضع الماصة الدقيقة عند الإحداثيات المناسبة على طول المحاور الإنسية والجانبية والأمامية الخلفية للرأس. اخفض الماصة الدقيقة حتى يخلق الطرف تقتقرا صغيرا على الجلد ، وأدر مقبض مناور المحور z بإحكام ولكن برفق لدفع الماصة الدقيقة عبر الجلد والجمجمة إلى الدماغ. اسحب الماصة الدقيقة قليلا حتى يحيط بطرفها مخروط من الجلد على شكل خيمة.

وعرض الإحداثيات على طول المحور z. ثم اخفض الماصة الدقيقة إلى العمق التجريبي المناسب وحقن الخلايا. انتظر 15 ثانية بعد تسليم الخلايا قبل سحب الماصة الدقيقة وكرر الحقن في مكان ثان إذا رغبت في ذلك.

ضع الجرو على وسادة تدفئة وراقبه حتى يتحقق الشفاء التام قبل نقله مرة أخرى إلى قفص المنزل. تهاجر الخلايا المطعمة عبر مناطق الدماغ المستهدفة بمعدلات بقاء متغيرة للخلايا تتراوح من العشرات إلى عدة آلاف. تتمركز الخلايا المطعمة داخل المناطق المناسبة مع العديد من الخلايا التي تعرض أشكال الخلايا العصبية الداخلية وعلامات كيميائية عصبية داخلية مميزة جيدا.

الخلايا المانحة وتنضج حتى عندما يتم تطعيمها في بيئات جديدة من خلال عمليات زرع غير متجانسة. يكشف التحليل الفيزيولوجي الكهربي للخلايا المطعمة عن خصائص فسيولوجية شبيهة بالبالغين وأنماط إطلاق مميزة ، تمثل الأنواع الفرعية المحددة جيدا من الخلايا العصبية الداخلية ، مما يشير إلى أن الخلايا العصبية الداخلية المطعمة قادرة على النضج بشكل صحيح في البيئة المضيفة. تظهر الخلايا المزروعة أيضا تيارات ما بعد المشبكي المثيرة التلقائية.

يكشف التسجيل من الخلايا الهرمية المجاورة للخلايا العصبية الداخلية المزروعة التي تعبر عن channelrhodopsin-2 عن تيارات GABAergic ما بعد المشبكي التي يثيرها الضوء الأزرق في هذه الخلايا الهرمية الذاتية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم إبقاء الخلايا على الجليد وتقطيع الخلايا برفق باستخدام ماصة باستور لتقليل موت الخلايا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الخلية المفردة على الخلايا المطعمة لتحديد كيفية تأثير التغيرات البيئية على نسخ الخلية بشكل كامل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على عزل سلائف الخلايا العصبية الداخلية من مناطق الدماغ المختلفة للصغار حديثي الولادة وزرع هذه الخلايا في مناطق مختلفة من الدماغ لصغار ما بعد الولادة المطابقة للعمر.