كالوريسبيروميتري: اتباع نهج موسع، قوية للتحقيق في استقلاب الطاقة الخلوية

تتمثل الأهداف العامة لهذا الإجراء في تحليل النشاط الأيضي للعينة البيولوجية وتحديد مدى مساهمة المسارات اللاهوائية في إنتاج الطاقة الخلوية داخل العينة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الصيدلاني حول مدى سمية الميتوكوندريا أثناء تطوير الدواء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل القياس المتزامن لاستهلاك الأكسجين وإنتاج الحرارة في عينة خلية ذات أهمية.

لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتخطيط العلاج أثناء التطوير الصيدلاني. يمكن تطبيقه أيضا على مجالات أخرى ، مثل علم الأحياء الشلوية حيث يمكن تقييم آثار التكييف الأيضي المسبق على الحفظ بالتبريد. لتحضير مقياس التنفس ، أضف أولا نقطتين إلى ملليلترين من DMEM إلى كل غرفة مقياس التنفس وأدخل السدادات بالكامل.

اضبط السدادات باستخدام أداة فاصل السدادة للسماح بانتشار الأكسجين الأمثل إلى الوسط ، واضبط الغرف على تحريك العينات باستمرار عند 750 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية حتى يصبح تركيز الأكسجين وتدفق الأكسجين مستقرين. تأكد من أن برنامج مقياس التنفس مبرمج لحساب قابلية ذوبان الأكسجين للوسيط المستخدم في التجربة. ثم حدد جزءا مستقرا من تتبع تركيز الأكسجين وقم بمعايرة هذا الجزء لتشبع الهواء بنسبة 100٪.

الآن ، أغلق السدادات ، مع الحرص على عدم وجود فقاعات في الغرف. بعد حوالي 10 دقائق ، يجب ملاحظة تدفق الأكسجين المستقر. للتحضير لقياس السعرات الحرارية ، أضف أولا اثنين من نقاط وخمسة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات إلى الأمبولة المرجعية ، ثم شد الغطاء.

باستخدام مضخة هواء ، قم بإزالة الحطام الخارجي من الأمبولة ، ثم اخفض الأمبولة ببطء لوضع واحدة في القناة المرجعية لمقياس السعرات الحرارية. ستبقى الأمبولة في الموضع الأول حتى يتم تحضير الأمبولة مع عينة الخلية. يجب أن يكون DMEM ، المستخدم في قياس السعرات الحرارية ، متوازنا في حاضنة 37 درجة مئوية مع جو رطب و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

ابدأ التجربة بإضافة ثلاثة ملليلتر من DMEM إلى صفيحة سعة 100 مليلتر لكل أمبولة حرارية سيتم استخدامها ، ووضع اللوحة في الحاضنة حتى تصبح العينة جاهزة للسعرات الحرارية. أثناء توازن الوسيط ، استخدم مجهرا مقلوبا لتحديد لوحة بها خلايا HepG2 يتراوح حجمها بين 60 و 80٪ ملتقية ويتم توزيعها بشكل متجانس. أولا ، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا وغسل الخلايا مرتين باستخدام 10 ملليلتر من PBS.

أضف ثلاثة ملليلتر من التربسين الدافئ مسبقا عند 37 درجة مئوية واحتضن الطبق عند 37 درجة مئوية. بعد سبع إلى 10 دقائق من الحضانة ، قم بتحييد التفاعل الأنزيمي بثلاثة ملليلتر من 37 درجة مئوية DMEM واستخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر لفصل الخلايا برفق في معلق أحادي الخلية. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر للطرد المركزي ، وأعد تعليق اللوحة في حوالي خمسة ملليلتر من DMEM الطازج.

قم بضرب الخلايا جيدا لتفكيك أي مجموعات خلايا ، وبعد العد ، قم بتركيز الخلايا إلى ما يقرب من مليوني خلية لكل 50 ميكرولتر من الوسط. تعتمد قابلية تكرار هذه الطريقة على تعداد الخلايا المتسق والدقيق. من الأهمية بمكان التأكد من أن العينة متجانسة وأن الخلايا لا تتكتل في أي وقت أثناء التحليل.

بعد ذلك ، قم بتخزين الخلايا على الجليد حتى تصبح جاهزة لإجراء قياسات التنفس والسعرات الحرارية. قبل قياس السعرات الحرارية ، تأكد من أن المسعر متصل بالكمبيوتر وأن الإشارة الحرارية مستقرة وبالميكروواط. قم بتخفيف الخلايا إلى 100،000 خلية لكل مليلتر في الوسط المتوازن الذي تم وضعه في الحاضنة قبل تحضير العينة.

ثم أضف اثنين من نقاط وخمسة ملليلتر من محلول الخلية إلى كل أمبولة ، مما يؤكد الحفاظ على حجم كاف من الهواء بين أغطية الأمبولات والوسط للسماح بانتشار الغاز. شد الأغطية على الفور وتنظيف الأمبولات محكمة الغلق بالهواء لإزالة أي حطام خارجي. ثم قم بخفض الأمبولة المختومة ببطء مع عينة الخلية لوضع أحد المسعرات.

امزج العينة جيدا لضمان محلول متجانس ، وحقن مليوني خلية في كل غرفة مغلقة من مقياس التنفس تحت التحريك المستمر. بعد 15 دقيقة في الموضع الأول في مقياس السعرات الحرارية ، قم بخفض كل من الأمبولة المرجعية والأمبولة ببطء مع الخلايا لوضع اثنين وتسجيل وقت الخفض. بعد 10 إلى 15 دقيقة من حقن الخلايا في مقياس التنفس ، يجب ملاحظة استقرار تدفق الأكسجين وانخفاض مطرد في تركيز الأكسجين.

لتحديد التنفس الناتج عن التسرب ، قم بحقن ميكرولتر واحد من أربعة ملليغرام لكل مليلتر من أوليغومايسين في كل غرفة واترك تدفق الأكسجين يستقر لمدة 10 دقائق تقريبا ، مع تسجيل معدل التنفس المستقر للتسرب كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، لتحديد التدفق الأقصى ، قم بحقن ميكرولترين من FCCP من نقطة صفر - مللي مولار في الغرفة ، مما يسمح لتدفق الأكسجين بالاستقرار بعد كل حقنة ، واستمر في المعايرة حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى للتدفق. سجل معدل التنفس المستقر أثناء التدفق الأقصى.

عندما تعمل غرفة مقياس التنفس قبل قياس العينة ، يجب أن يكون كل من تركيز الأكسجين وآثار تدفق الأكسجين مستقرة. بعد خفض الأمبولة إلى الموضع الثاني ، يمكن تحديد فترة زمنية يكون فيها ناتج الحرارة مستقرا ، ويمكن تحديد الوقت المقابل الذي يكون فيه تدفق الأكسجين مستقرا ، للسماح بحساب نسبة قياس السعرات الحرارية. إذا تمت زراعة خلايا HepG2 في غياب الجلوكوز ويتم استكمال الجالاكتوز لزيادة مشاركة الميتوكوندريا ، فإن الخلايا لا تتكاثر داخل المسعر ، ولكن بدلا من ذلك تقلل من نشاطها الأيضي بعد حوالي 30 دقيقة في الأمبولة ، مما يحد من حساب قياس السعرات الحرارية إلى أقرب نقطة زمنية تم فيها قياس تبديد الحرارة.

من الأهمية بمكان تسجيل الوقت الذي يتم فيه سحب الخلايا في الأمبولة بحيث يتم جمع قياسات إنتاج الحرارة واستهلاك الأكسجين في نقاط زمنية متطابقة ، حيث يستغرق الأمر حوالي 15 دقيقة حتى يستقر تدفق الأكسجين وينخفض تركيز الأكسجين بشكل مطرد. نظرا لأن تدفق الأكسجين المستقر للخلايا يعمل كبديل لاستهلاك الأكسجين عند حساب نسبة قياس السعرات الحرارية ، يمكن إجراء معايرة إضافية لتقييم التنفس الناتج عن التسرب ، والذي يشار إليه من خلال انخفاض في تدفق الأكسجين والحد الأقصى للتنفس غير المقترن ، والذي يشار إليه بالفشل في زيادة التنفس مع معايرة FCCP المتتالية. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في أقل من أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن خطوط الخلايا الأخرى قد يكون لها خصائص استقلابية مختلفة. لذلك ، يجب تحسين كل خط خلية جديد لكل من قياسات السعرات الحرارية وقياس التنفس. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير خلايا HepG2 لقياس السعرات الحرارية لضمان المعايرة الآلية الصحيحة ، وإجراء تجربة قياس السعرات الحرارية بشكل صحيح.