فحص الخلوي على أساس تدفق لقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا في Myocytes القلب بعد نقص/ريوكسيجينيشن
يوليو 13, 2018
نقدم هنا، هو بروتوكول يستخدم صبغ جيمي كارتر-1 لتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الخلايا بعد التعرض لنقص/ريوكسيجينيشن مع أو بدون عامل واقية.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في قياس تأثير نقص الأكسجة / إعادة الأكسجة على الخلايا في إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، ويمكن استخدامها لتقييم ما إذا كان العامل يحمي من الإصابة. الميزة الرئيسية لهذا الاختبار هي أن MMP الذي تم اكتشافه من خلال ذلك هو في حالة وجود عوامل مثل حجم الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك ، لديها متطلبات منخفضة للمواد والإشراق.
ابدأ ب 70٪ من الخلايا العضلية القلبية البشرية المتجمعة في صفيحة من ستة آبار. بعد غسل الخلايا بمحلول ملحي عازل للفوسفات ، أضف دواء أو مركبة في ملليلتر من المصل وDMEM الخالي من الجلوكوز. احتضن في حاضنة زراعة الخلايا التي تحتوي على 5٪ CO2 و 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل نقص الأكسجة.
بعد 30 دقيقة ، ضع طبق الخلايا العضلية القلبية البشرية في وعاء محكم الغلق سعة 2.5 لتر. مزود بمحفز لمسح الأكسجين الحر ، ومؤشر لامنهجي لقياس توتر الأكسجين في الوسط. ضع البرطمان في حاضنة زراعة الأنسجة.
يتغير لون المؤشر لاالنوعي من الأزرق الفاتح في البيئة العادية إلى الأبيض الباهت في ظروف نقص الأكسجة. أعد أكسجة الخلايا العضلية القلبية البشرية عن طريق إزالة صفيحة الآبار الستة من البرطمان ووضعها على رف الحاضنة لمدة ساعتين. بعد إعادة الأكسجين ، اشطف الخلايا بملليلتر واحد من PBS الدافئ مسبقا ، وأضف 0.5 ملليلتر من التربسين الدافئ مسبقا بنسبة 25٪ على طول جدار البئر.
احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة تقريبا حتى تنفصل جميع الخلايا العضلية القلبية البشرية تقريبا. ثم أضف ملليلترا واحدا من وسيط DMEM الكامل إلى الآبار لتحييد التربسين. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر ، وأجهزة HCMs للبيليه عن طريق الطرد المركزي عند 500 مرة G لمدة ثلاث دقائق ، في درجة حرارة الغرفة.
بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج الكريات. ثم أضف 5 ملليلتر من الوسط الكامل لخلايا عضلة القلب البشري ، و 5 ملليلتر من محلول عمل JC-1 لكل أنبوب. أعد تعليق HCMs عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لمنع تبييض مؤشر الفلورسنت ، واحتضان الخلايا في الظروف العادية لمدة 20 دقيقة. بعد تكوير الخلايا العضلية القلبية البشرية عن طريق الطرد المركزي عند 500 مرة G لمدة ثلاث دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا إلى أربع درجات مئوية ، اشطف الخلايا مرتين بملليلترين من محلول تلطيخ JC-1 البارد. بعد الشطف الثاني ، قم بتعليق الخلايا العضلية القلبية البشرية في 300 ميكرولتر من محلول تلطيخ الجليد
.وتصفية العينات في أنابيب العينة المعنية. تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي في غضون 30 دقيقة. ابدأ تشغيل مقياس التدفق الخلوي وتأكد من توصيل البرنامج.
قم بإجراء بدء تشغيل السوائل. ابدأ البث ، وقم بإعداد الفاصل. افتح نافذتين نقطتين في برنامج قياس التدفق الخلوي.
حدد الضوء المتناثر إلى الأمام على المحور X ، والضوء الجانبي المتناثر على المحور Y في مخطط النقطة الأولى. لتمثيل خصائص الخلايا من حيث حجمها ودقة حجمها ، على التوالي. حدد قناة الكشف عن PE للمحور Y.
و FITC للمحور X ، باستخدام مقياس لوغاريتمي في مخطط النقطة الثاني ، والذي يستخدم لقياس شدة الإزهار لصبغة JC-1 في الخلايا. انقر فوق التفريغ للسماح لذراع دعم الأنبوب، ووضع أنبوب العينة الفارغ الذي يحتوي على الخلايا العضلية القلبية البشرية التي لم يتم صبغها باستخدام JC-1. انقر فوق التحميل لإعادة ذراع الدعم إلى وضع عمله.
انقر فوق سجل لجمع الجسيمات من التعليق في أنبوب العينة الفارغ. واضبط الفولتية لقنوات الفلوريسنس في مخطط النقطة الثانية. قم ببوابة مجموعة الخلايا لمزيد من التحليل في المخطط النقطي الأول.
بعد ذلك ، قم بتحليل الخلايا العضلية القلبية البشرية. اعرض إحصائيات كل أنبوب عينة واحسب MMPs لكل عينة بقسمة نسبة شدة الطحين الأحمر على شدة الطحين الأخضر. يؤدي نقص الأكسجة وإعادة الأكسجة إلى تحفيز موت الخلايا المبرمج للخلايا العضلية القلبية البشرية بشكل كبير ، مقارنة بالخلايا الطبيعية كما تم قياسها بواسطة نسبة Annexin PI.
الطب التقليدي الصيني ذو التأثيرات الوقائية للقلب ، منع موت الخلايا المبرمج ل HCMs بعد نقص الأكسجة / إعادة الأكسجين. كما هو موضح هنا ، كانت نسبة JC-1 الحمراء / الخضراء بعد العلاج ب CCP للميتوكوندريا صفرا تقريبا. بما يتفق مع نتائج مقايسة موت الخلايا المبرمج.
أظهرت المجموعة المعالجة H / R نسبة حمراء / خضراء أقل بكثير ، مقارنة بالمجموعة العادية. وعكست مثل هذا التغيير في النسبة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر بدء تشغيل الخلايا المحملة ب JC-1 في عازلة دائمة على الجليد ، حيث أن درجة الحرارة لها تأثير كبير على ثبات إمكانات غشاء الميتوكوندريا.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التلاعب الجيني للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كان انخفاض MMP ناتجا عن فتح MPTP.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يستخدم هذا البروتوكول صبغة JC-1 لتقييم الجهد الغشائي للميتوكوندريا (MMP) للخلايا المعرضة لنقص الأكسجة/إعادة الأكسجة. كما يقيم التأثيرات الواقية للعوامل ضد الأذية الخلوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- وظيفة الميتوكوندريا
- بحث نقص الأكسجة
الخلفية
- الجهد الغشائي للميتوكوندريا ضروري لبقاء الخلية.
- نقص الأكسجة/إعادة الأكسجة يمكن أن يؤدي إلى الأذية الخلوية.
- قد تعمل العوامل الواقية على تخفيف هذه التأثيرات.
- صبغة JC-1 هي مؤشر موثوق للتغيرات في MMP.
هدف الدراسة
- قياس تأثير نقص الأكسجة/إعادة الأكسجة على MMP.
- تقييم التأثيرات الواقية للعوامل المحددة.
- توفير اختبار منخفض المواد لتقييم MMP.
الطرق المستخدمة
- زراعة الخلايا العضلية القلبية البشرية إلى 70٪ من الكثافة.
- غسل الخلايا بمحلول فوسفات عازل.
- حضانة مع دواء أو مركب في DMEM خالٍ من المصل.
- تعرض الخلايا لظروف نقص الأكسجة لتقييمها.
النتائج الرئيسية
- أظهرت التغيرات في MMP بسبب نقص الأكسجة/إعادة الأكسجة.
- حددت التأثيرات الواقية للعوامل على MMP.
- أظهرت متطلبات منخفضة من المواد للاختبار.
- أبرزت تأثير حجم الميتوكوندريا على اكتشاف MMP.
الاستنتاجات
- اختبار JC-1 فعال لتقييم تغيرات MMP.
- العوامل الواقية يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نتائج MMP.
- هذه الطريقة سهلة الاستخدام وفعالة للدراسات الخلوية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial membrane potential (MMP) is critical for evaluating cardioprotective strategies in ischemia-reperfusion injury models. This flow cytometry-based JC-1 assay provides a quantitative, high-throughput readout of mitochondrial depolarization in human cardiac myocytes, enabling mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting reperfusion injury. The method supports target validation by linking MMP changes to mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, a key event in cardiomyocyte death.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures MMP as a functional readout of mitochondrial health and mPTP opening in disease-relevant human cardiac myocytes.
- Operational Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding cytoprotective agents under hypoxia/reoxygenation stress.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating MMP preservation with reduced apoptosis, as demonstrated by Annexin PI ratio.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: JC-1’s red/green fluorescence ratio provides a ratiometric, mitochondria-specific readout independent of cell size or granularity.
- Operational Value: Low material requirements and compatibility with standard flow cytometry platforms support assay scalability and reproducibility.
- Screening Readiness: Enables rapid evaluation of compound libraries for effects on MMP in a physiologically relevant human cell model.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses human cardiac myocytes to enhance translational relevance over rodent models in ischemia-reperfusion studies.
- Operational Value: Standardized hypoxia/reoxygenation protocol allows consistent induction of mitochondrial depolarization for compound testing.
- Predictive Value: Facilitates go/no-go decisions by linking MMP protection to functional outcomes like reduced apoptosis.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation and lead identification by providing mechanistic insights into mitochondrial dysfunction in cardiovascular disease models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of MMP as a biomarker of mPTP activation and reperfusion injury severity.
- Screening: Delivers quantitative, normalized fluorescence ratio data suitable for hit selection and dose-response profiling.
- Analytics: Generates red/green intensity ratio metrics that allow statistical comparison across treatment groups.
- Translational Research: Uses human-derived cells to improve predictive confidence for preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted across cardiotoxicity and cardioprotection screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mitochondrial depolarization as a convergent point of reperfusion injury pathways.
- Operational Value: Minimizes variability by normalizing MMP readout to mitochondrial content via ratiometric JC-1 detection.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of compounds that preserve MMP and reduce apoptotic commitment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating MMP stabilization in human cardiac myocytes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cardiac myocyte culture and hypoxia/reoxygenation modeling.
- Dependent on flow cytometry with FITC and PE detection channels and logarithmic fluorescence scaling.
- Necessitates strict temperature control during JC-1 staining to preserve mitochondrial membrane potential integrity.
- Requires standardization of hypoxia duration and reoxygenation timing across experimental groups.
- Limited to adherent cell types amenable to trypsinization and washing without loss of viability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Establishment of Hypoxia/Reoxygenation Model
1:57
Preparation of HCMs for Flow Cytometry
3:49
Flow Cytometer Setup
4:43
Flow Cytometry Measurement and Data Analysis
5:40
Results: Validation of the Establishment of Hypoxia/Reoxygenation (H/R) Model by Flow Cytometry
6:34
Conclusion
