إنتاج بروتين الايلاستين مثل الهلاميات المائية للتغليف وإيمونوستينينج من الخلايا في 3D

الهدف العام من هذا البروتوكول هو التعبير عن البروتينات الشبيهة بالإيلاستين المشتقة مؤتلفا وتنقيتها لاستخدامها كهيدروجيل قابل للضبط لتغليف الخلايا ثلاثية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك ، يقدم هذا البروتوكول منهجية وضع العلامات الفلورية النهائية في الفحص المجهري متحد البؤر للخلايا المغلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات المواد الحيوية والطب التجديدي وبيولوجيا الخلية ، مثل فهم دور تفاعلات المصفوفة الخلوية خارج الخلية في 3D.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر منصة مواد قابلة للتكرار وقابلة للضبط ومعيارية قابلة لدراسة أنواع الخلايا المتعددة. بشكل عام ، يمكن أن يؤدي تنفيذ هذه التقنية إلى تحسين فهمنا لمعلمات إشارات ECM للخلايا الهامة التي قد تملي نجاح العلاجات التجديدية القائمة على الخلايا في المستقبل. قم بربط صفيحة أجار أمبيسلين وكلورامفينيكول مع مخزون بكتيري مسبق الصنع يحتوي على ناقل يشفر ELP محل الاهتمام.

ثم احتضان الصفيحة المخططة رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية طوال الليل للسماح بنمو البكتيريا. في اليوم التالي ، اختر مستعمرة واحدة من الطبق وقم بتلقيح ثقافة البادئ الدافئة مسبقا. احتضان الثقافة في شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.

بعد فترة الحضانة ، استخدم ماصة مصلية لنقل 20 مل من ثقافة البادئ إلى كل قارورة تعبير. اترك قارورة التعبير تهتز لمدة ساعة. بعد ساعة واحدة ، قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر من لقوبة من قارورة التعبير.

بمجرد أن تصل القراءة إلى 0.6 ، قلل درجة حرارة الخلاط إلى 32 درجة مئوية. عندما تصل القراءة إلى 0.8 ، أضف ملليلترا واحدا من IPTG معقم مولار واحد للحث على تعبير ELP في قارورة التعبير. اسمح للثقافة بالتعبير لمدة سبع ساعات.

بعد سبع ساعات ، قم بالطرد المركزي لوسائط التعبير عند 12،000 × جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي أرضي. بعد الطرد المركزي ، استخدم ملعقة لجمع حبيبات الخلية من حاوية أجهزة الطرد المركزي وضعها في كيس ziploc موزن مسبقا. بعد ذلك ، قم بإذابة حبيبات الخلية في مخزن مؤقت معقم مفلتر

قم بتدليك حبيبات الخلية لتشكيل محلول متجانس. قم بتجميد كيس ziploc بحبيبات الخلية المعلقة في حاوية ثانوية عند 80 درجة مئوية. إلى حبيبات الخلية المذابة ، أضف ما يقرب من 30 إلى 40 ملليغرام من ديوكسي ريبونوكلياز ومليلتر واحد من 100 ملليمولر PMSF لكل 100 ملليلتر من محللة الخلية.

احتضن المحللة عند أربع درجات مئوية على شاكر طوال الليل. بعد دورة التجميد والذوبان الثالثة ، قم بالطرد المركزي للعينات على الأقل 15،000 × جم لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، اسكب المادة الطافية من حاوية الطرد المركزي وانقل المحلول إلى حاوية طرد مركزي جديدة.

إلى كل 100 مل من المادة الطافية ، أضف 5.84 جرام من كلوريد الصوديوم في ثلاثة أجزاء إلى تركيز مولي أخير. احتضان المعلق في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينات على الأقل 15،000 × جم لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية من حاوية الطرد المركزي وقم بتجميع الحبيبات. بعد ذلك ، أضف 10 مل من الماء عالي النقاء المعقم لكل جرام من الحبيبات التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي. للتأكد من ذوبان البروتين تماما ، استخدم ملعقة معدنية لهرس الحبيبات وإعادة تعليقها.

احتضان الحبيبات المعلقة عند أربع درجات مئوية طوال الليل على شاكر مداري. كرر خطوات الطرد المركزي الباردة والساخنة لما مجموعه ثلاث دورات لتنقية ELP بشكل أكبر. بعد ذلك ، قم بطلب المادة الطافية المتبقية في غشاء غسيل الكلى 3.5 كيلو دالتون مقابل أربعة لترات من الماء عالي النقاء المبرد مسبقا عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة أيام لتحلية محلول البروتين.

جهاز طرد مركزي المحلول النهائي الممحلول في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا. قم بتجميد المادة الطافية عند 80 درجة مئوية في أنبوب مخروطي الوزن مسبقا. أخيرا ، قم بتجميد المحلول المجمد لمدة ثلاثة أيام ثم قم بوزن المنتج النهائي المجفف بالتجميد لتحديد إنتاجية البروتين.

بمساعدة لكمة الخزعة ، قم بعمل ثقوب في لوح سيليكون بسمك 0.5 ملم. ثم قطع مربع حول كل حفرة. بعد ذلك ، استخدم الملقط لإزالة الغلاف البلاستيكي على كل جانب من القوالب الفردية.

بعد إزالة الغلاف البلاستيكي ، استخدم الملقط لوضع العدد المتطابق من قوالب السيليكون العارية وزلقات الغطاء الزجاجي في صفوف متناوبة على غطاء لوحة 48 بئر لربط البلازما اللاحق. بعد تصنيع جميع مواد زراعة الخلايا ، قد يبدأ إعداد نوع الخلية الذي يهم لتغليف الهيدروجيل النهائي. بعد تفكيك الخلايا في معلق خلية واحدة ، قم بتقسيم العدد المطلوب من الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر.

ثم ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند حوالي 200 × جم لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية وتخزين الحبيبات على الجليد. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول مخزون ELP إلى 80٪ من الحجم النهائي.

ثم استخدم ماصة لخلط المحلول في معلق متجانس للخلايا في ELP. بالنسبة للحجم النهائي المتبقي بنسبة 20٪ ، أضف محلول مخزون THPC إلى تعليق ELP الخلوي. الماصة عدة مرات لضمان تكوين خليط متجانس ، مع تجنب تكوين فقاعات الهواء.

بعد ذلك ، في حركة دائرية ، قم بإدخال ماصة خليط ELP THPC الخلوي في كل قالب في صفيحة 24 بئرا. ثم احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إضافية.

بمجرد انتهاء الحضانة ، أضف بعناية 750 ميكرولترا من وسط زراعة الخلايا الدافئة إلى كل بئر في طبق 24 بئر. اترك الهيدروجيل عند 37 درجة مئوية لمدة الثقافة المطلوبة. أولا ، استنشق الوسط من كل بئر.

ثم اغسل الآبار بملليلتر واحد من DPBS الدافئ. بعد اكتمال الغسيل ، أضف 750 ميكرولتر من محلول التثبيت إلى كل بئر. ثم احتضن صفيحة 24 بئرا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة ، قم بشفط محلول التثبيت من كل بئر وتخلص من المثبت في حاوية نفايات خطرة. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من DPBS إلى العينة وتخلص من DPBS على الفور في حاوية نفايات خطرة. بعد ذلك ، أضف 750 ميكرولتر من محلول النفاذية لنفاذية العينة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على الروك بمعدل 15 دورة في الدقيقة.

بعد ساعة واحدة ، قم بشفط محلول النفاذية وأضف 750 ميكرولتر من محلول الحجب إلى العينة. اترك العينة على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات. ثم قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية المرغوبة بمحلول تخفيف الأجسام المضادة.

بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد لكل عينة. احتضان العينات طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، استنشق محلول الجسم المضاد الأساسي ، ثم اغسل العينات باستخدام PBST لمدة ساعة واحدة ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة بمعدل 15 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في خمسة ملليغرام لكل مليلتر من محلول مخزون DAPI لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. ثم أضف 500 ميكرولتر من المحلول إلى كل عينة. بعد ذلك ، استخدم رقائق الألومنيوم لتغطية لوحة 24 بئر واحتضان اللوحة عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، قم بشفط محلول الجسم المضاد الثانوي واغسل العينات باستخدام PBST ثلاث مرات لكل منها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على هزاز. بعد ذلك ، ضع قطرة من وسيط التثبيت الصلب على سطح شريحة زجاجية وضع العينة على وسط التثبيت. أخيرا ، استخدم طلاء الأظافر لإغلاق العينات بشريحة الغطاء الزجاجي لمنع التلوث أو حركة العينة.

هنا ، يتم التحقق من صحة التعبير عن البروتين المستهدف بطول ELP الكامل في ظل ظروف خاضعة للرقابة من خلال وجود نطاقات عند 37 كيلوڈالتون في كل من SDS-PAGE وتحليل اللطخة الغربية. ومع ذلك ، في ظل ظروف غير خاضعة للرقابة ، يمكن أيضا رؤية العديد من نطاقات الوزن الجزيئي المنخفضة باستخدام اللطخة الغربية. تتوافق نطاقات الوزن الجزيئي المنخفضة مع البروتينات التي تحتوي على أقل من أربعة تكرارات تشبه الإيلاستين ، مما يشير إلى أن البروتين لا يترجم بالكامل أثناء التعبير.

هذه النتيجة شائعة عند إجراء التعبير فوق 32 درجة مئوية. لتغيير تركيز الترابط اللاصق للخلية مع الحفاظ على الخصائص الميكانيكية للهيدروجيل ثابتة ، يتم ضبط نسبة متغير ELP الذي يحتوي على مادة لاصقة للخلية المشتقة من الفيبرونكتين والتسلسلات اللاصقة غير الخلوية. علاوة على ذلك ، فإن الخلايا السلفية العصبية للفئران قابلة للحياة أيضا على مدى سبعة أيام عند تغليفها في هيدروجيل ELP بنسبة 3٪.

يتم تحديد الخلايا الحية باللون الأخضر بسبب صبغة الكالسيين AM ، في حين أن الخلايا الميتة تمتص الخلايا الميتة homodimer الإيثيديوم الأحمر بشكل تفضيلي. للتحقق من صحة النمط الظاهري للخلايا الجذعية للخلايا السلفية العصبية ، يتم أيضا تصور التعبير عن العلامات الكنسية مثل Sox2 و nestin عن طريق التلوين المناعي عندما يتم تغليف الخلايا في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد ELP. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن البروتين الشبيه بالإيلاستين وتنقيته من أجل تغليف المصب لأنواع مختلفة من الخلايا ، بالإضافة إلى التحقيق في دور البيئة المكروية ثلاثية الأبعاد في تعديل النمط الظاهري الخلوي.