تحليل AtHIRD11 اضطرابات جوهرية وملزمة تجاه أيونات المعادن بالتفريد جل الشعرية وتقارب التفريد الشعرية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة ببروتينات الاضطراب الجوهري في التكتونية مثل التغيرات التوافقية بسبب ارتباط الحديد المعدني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتطلب القليل جدا من المعدات ويمكن الحصول على النتائج بسرعة كبيرة. سيوضح الإجراء ماتياس شتاين ، طالب دراسات عليا من مختبري.

للبدء ، استخدم قاطع زجاج على صفيحة زجاجية لقطع شعرية السيليكا المنصهرة العاري بطبقة خارجية من مادة البولي أميد وقطر داخلي يبلغ 50 ميكرون إلى أطوال 33 و 30 سم. استخدم قلما لتمييز منتصف نافذة الكشف بعرض سنتيمتر واحد على مسافة 24.5 سم من أحد طرفي الشعيرات الدموية لتجربة CGE وعلى بعد 21.5 سم من أحد طرفي الشعيرات الدموية لتجربة ACE. باستخدام موقد اللحام ، احرق الطلاء الخارجي من مادة البولي أميد 0.5 سم قبل وبعد كل علامة.

وبالمثل ، استخدم موقد اللحام لإزالة سنتيمتر واحد من الطلاء على طرفي الشعيرات الدموية. بعد ذلك ، استخدم الإيثانول والأنسجة الرخوة لتنظيف نهايات الشعيرات الدموية ونوافذ الكشف. قم بتثبيت الشعيرات الدموية في نظام CE مع نافذة الكشف بالقرب من المخرج.

بعد تحضير المحاليل ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدم محلول كلوريد الكالسيوم 250 ميكرومولار لملء حقنة سعة 10 مل. ثم قم بتوصيل مرشح PVDF 0.2 ميكرون بالمحقنة وادفع 2 مل من المحلول عبر الفلتر للتخلص منه. استخدم كلوريد الكالسيوم المتبقي في المحقنة لملء 10 قوارير حتى الحد الأقصى المسموح به.

قم بتسمية كل قارورة على أنها قارورة مدخل محلول كلوريد الكالسيوم 250 ميكرومولار. بعد ذلك ، باستخدام محلول كلوريد الكالسيوم ، املأ 10 قوارير في منتصف الطريق. ضع علامة على كل منها على أنه قارورة مخرج محلول كلوريد الكالسيوم 250 ميكرومولار.

ثم ، مع المحاليل الأخرى التي تحتوي على ملح معدني ، املأ القوارير بطريقة مماثلة. بالإضافة إلى ذلك ، لكل زوج من قوارير المدخل والمخرج ، استخدم 30 ميكرومولار Tris Buffer لإعداد مجموعة مماثلة من قوارير المدخل والمخرج. مع 60 علامة EOF من الأسيتانيليد الميكرومولار ، املأ 10 قوارير.

ثم استخدم محلول عينة واحد مليغرام لكل مليلتر لملء قارورة واحدة. بعد إعداد التحليل ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بتشغيل الفصل عن طريق حقن محلول العينة هيدروديناميكيا لتجارب CGE وتطبيق 0.1 بار لمدة أربع دقائق عند المدخل. ثم قم بتطبيق سالب 16.5 كيلو فولت وضغط 2.0 بار على طرفي الشعيرات الدموية لمدة 25 دقيقة.

بعد تحضير طريقة القياسات بدون روابط ، قم بإعداد طريقة القياسات باستخدام الروابط أولا باستخدام محلول EDTA 0.1 مولار لشطف الشعيرات الدموية عند 2.5 بار لمدة دقيقة واحدة. ثم استخدم الماء منزوع الأيونات لشطف الشعيرات الدموية. بعد ذلك ، قم بموازنة الشعيرات الدموية باستخدام محلول الترابط لشطفها عند 2.5 بار لمدة 1.5 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بحقن محلول الأسيتانيليد عند 0.05 بار لمدة 6 ثوان وقم بتغيير قوارير المدخل والمخرج إلى القوارير العازلة التي تحتوي على الترابط. ضع 0.05 بار لمدة 2.4 ثانية لدفع محلول الأسيتانيليد إلى الداخل من طرف الشعيرات الدموية. ضع 10.0 كيلو فولت لمدة 6 دقائق واكتشف ذروة أسيتانيليد الأصول بطول موجي يبلغ 200 نانومتر.

بعد شطف الشعيرات الدموية بالماء منزوع الأيونات EDTA ومحلول الترابط ، كما كان من قبل ، قم بحقن عينة البروتين وتغيير قوارير المدخل والمخرج إلى قوارير عازلة جديدة تحتوي على قوارير عازلة. بالتناوب ، كرر أخذ القياسات مع وبدون روابط. ثم كرر الطريقة باستخدام محاليل الترابط الأرضي القلوية.

أخيرا ، استخدم الحلول التالية لتنفيذ نفس الطريقة. بعد ذلك ، احسب التغيير في نسب حجم الشحنة لتفاعلات أيون معدن البروتين المختلفة. يظهر هنا مخطط الكهربية لعينة AtHIRD11 التي تم الحصول عليها أثناء تجارب CGE.

يزداد حجم الببتيد من اليسار إلى اليمين. الذروة رقم أربعة لها أكبر كتلة وتشير إلى البروتين السليم. تمثل القمم الأصغر ، اثنان وثلاثة ، شوائب أصغر.

يمثل هذا الشكل مخطط الكهربية للأسيتانيليد أثناء تجارب ACE. يظهر محلول الأسيتانيليد ذروة عالية واحدة فقط لأنه لا ينبغي أن يحتوي على شوائب. يشير وقت الكشف عن الحد الأقصى للذروة إلى وقت ترحيل التدفق الكهربائي ويستخدم لحساب التفاعل.

تم إجراء هذا الرسم الكهربائي لعينة AtHIRD11 أثناء تجربة ACE في غياب SDS وأيونات المعادن. إلى جانب الشوائب من مخطط الفرمون الكهربائي CGE ، توجد خمس قمم على الأقل مرتبطة بالبروتين نفسه. يظهر هنا تقييم بياني لتحولات وقت الهجرة المقاسة في وجود أيونات المعادن المختلفة للذروة السادسة.

يتم تمثيله بالقيمة المحسوبة Delta R على التردد اللاسلكي. تشير كل نتيجة إلى مدى قوة التحول الذي حدث من خلال قيمته وعلامته كما يتضح من التغيير الكلي في مسؤولية مجمعات أيونات معدن البروتين. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية لشريك تفاعل واحد في ثماني ساعات بما في ذلك تفاعل CGE إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تغيير محاليل البروتين لقياسات طويلة الوقت لأن منتجات التحلل يمكن أن تزداد بمرور الوقت وتغيير محاليل Tris Buffer من أجل الحصول على نتائج أكثر دقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قطع وتنظيف الشعيرات الدموية ، بالإضافة إلى إعداد طريقة الرحلان الكهربائي للشعيرات الدموية ، من أجل تقييم سلوك الربط للبروتينات المضطربة الجوهرية.