الأمثل لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن لعزل Ganglia المعوي من الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الجهاز العصبي المعوي ، مثل ملف تعريف التعبير عن العقد المعوية في أمعاء البشر البالغين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها للحصول على عوائد عالية من الحمض النووي الريبي من العقد المعوية البشرية مع الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي إلى أقصى حد. ابدأ بقطع الأنسجة المعوية إلى أطوال 20 سم.

أولا ، قم بقص الأنسجة الدهنية والضامة. تجنب خدع المصل ، مما قد يؤدي إلى تلف هيكلي للضفيرة العضلية المعوية. بعد ذلك ، قم بعمل شق طولي على طول العينة المشذبة بالكامل ، ويفضل أن يكون ذلك في موقع التعلق المساريقي.

بعد ذلك ، قم بتشريح والتخلص من taeniae coli من القولون حتى يتسطح الأنسجة. الآن ، افرد الأمعاء ، بحيث يكون جانب الغشاء المخاطي لأسفل ، على لوح تقطيع مبرد. ثم قم بقص شرائط بعرض 1.25 سم على طول الأنسجة بالكامل.

أثناء قطعها ، انقل كل قطعة إلى محلول تخزين الأنسجة المبردة للتخزين المؤقت. بعد ذلك ، قم بتقطيع كل شريط إلى شرائح يتراوح طولها بين سنتيمترين و 1.5 سم. بعد تقطيع الشريط إلى شرائح ، جفف الشرائح.

من المهم أن تكون الأنسجة جافة جدا حتى لا تتشكل بلورات الثلج على الأنسجة عند تجميدها. الآن ، رتبي قطع الأنسجة المجففة ، بحيث يكون جانب الغشاء المخاطي لأعلى ، على قالب بلاستيكي بارد يمكن التخلص منه. بعد ذلك ، قم بتسطيح كل قطعة باستخدام ملقط منحني لإزالة فقاعات الهواء المحبوسة.

سوف تتوسع الأنسجة عندما يتم تسويتها بالسطح. بعد تسطيح أجزاء الأنسجة ، قم بتقييم سمكها قبل التجميد. إذا لزم الأمر ، ادفع حواف العينة إلى الداخل حتى تقترب العينة المعوية من سمكها الأصلي.

الآن ، انقل قالب القاعدة المحمل إلى ملاط من الثلج الجاف و 2-ميثيل بوتان. يجب أن تتجمد الأنسجة تماما في غضون 30 إلى 60 ثانية. بعد ذلك ، جفف قاع القالب على الفور باستخدام مناديل باردة محفوظة على الثلج الجاف.

الآن ، تحقق من العينة. لاحظ أي عينات لا تبدو مسطحة. بعد ذلك ، لف القالب بورق الألمنيوم الذي تم تسميته مسبقا وتبريده قبل الاستخدام.

ثم قم بتغطية ورق القصدير بطبقة من غلاف بلاستيكي لتقليل الجفاف. احتفظ بالعينات على الجليد حتى يمكن تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد تحضير المواد المطلوبة ، اسكب كومة من ثلاثة إلى خمسة ملليمترات من TFM على حامل عينة ناظم البرد كبير وانقل العينة المعوية على الفور ، جانب المصل لأعلى ، إلى TFM.

بعد بضع ثوان في درجة حرارة الغرفة ، انقل حامل العينة إلى الثلج الجاف وقم بتغطيته بمسحوق الثلج الجاف. قبل التقطيع ، تأكد من أن TFM أسفل مستوى الضفيرة العضلية المعوية. بعد ذلك ، قم بتركيب حامل العينة في رأس عينة ناظم البرد وقم بمحاذاة العينة مع شفرة ناظم البرد.

اجعل مستوى الضفيرة العضلية المعوية موازيا لشفرة القطع. الآن ، قم بعمل ثمانية أقسام ميكرون من خلال المصل والعضلة الطولية حتى تصل إلى الضفيرة العضلية المعوية. لتحديد موقع الضفيرة العضلية المعوية ، قم بتركيب عينة وصخها بصبغة مائية ، مثل البنفسجي الكريستالي بنسبة 1٪.

للمضي قدما ، حدد التقاطع بين طبقات العضلات الطولية والدائرية. في بداية التقسيم ، سيتم تمييز المصل بوجود النسيج الضام. قد تكون بعض الدهون المساريقية المتبقية موجودة أيضا على طول المصل.

بعد ذلك ، تصبح ورقة طبقة العضلات الطولية الخارجية مرئية بمجرد الوصول إلى الحدود بين طبقات العضلات الطولية والدائرية ، سيتم ملاحظة جزء من العقد المعوية. في الأقسام العديدة التالية ، ستصبح الضفيرة العضلية المعوية واضحة جدا مع وجود مساحات كبيرة من العقد داخل قسم واحد. الآن ، اجمع الأقسام التسلسلية للتشريح الدقيق لالتقاط الليزر.

قم بتبريد شرائح PEN في ناظم البرد لمدة خمس إلى 10 ثوان واستخدمها لتركيب الأقسام. ستحتوي أفضل الأقسام على الكثير من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. الآن ، انتقل إلى تلطيخ الأقسام ثم جففها كما هو موضح في بروتوكول النص.

أثناء التحضير ، أدخل خرطوشة من أغطية LCM في مرحلة مجهر LCM. بعد ذلك ، قم بتحميل نموذج الشريحة على المسرح واحصل على صورة نظرة عامة على الشريحة. حدد الموقع المطلوب ل LCM وقم بتحميل غطاء على الشريحة.

بعد ذلك ، قم بمحاذاة ليزر الأشعة تحت الحمراء واضبط قوة الليزر ومدته لبقعة التقاط قطرها 20 إلى 30 ميكرون. بعد ذلك ، حدد العقد المطلوبة لجمعها. تأكد من البقاء داخل حدود المنطقة القابلة للتحصيل على الغطاء ، والذي يتم عرضه كدائرة خضراء.

لكل من العقد الموضحة بأثر قطع الأشعة فوق البنفسجية ، اضبط بقع الأشعة تحت الحمراء بحيث يكون هناك بقعة IR واحدة على الأقل كل 100 إلى 500 ميكرون لضمان جمع العقد عند رفع الغطاء عن العينة. ثم اضغط على الزر IR UV Cut لمتابعة جمع جميع العقد المميزة. بمجرد اكتمال التحصيل، انقل الحد الأقصى إلى موقع جديد وكرر عملية التحصيل.

يمكن تكرار ذلك لمدة 60 إلى 80 دقيقة. عندما يتم تحميل غطاء LCM بعقد كافية ، قم بنقله إلى محطة مراقبة الجودة. في حالة وجود حطام على الغطاء ، امسحه باستخدام فرشاة طلاء ذات رؤوس دقيقة تم تحضيرها لاستخدام الحمض النووي الريبي.

استخدم طرف ماصة لأي حطام يصعب إزالته. بعد ذلك ، قم بتثبيت الغطاء على أنبوب ميكرو فوج سعة 0.5 مليلتر مملوء ب 230 ميكرولتر من محلول تحلل الحمض النووي الريبي. اقلب الغطاء ، وقم بدوامه لفترة وجيزة ، ثم احتضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

في وقت لاحق ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة خمس دقائق عند 5 ، 000 جم أو أسرع ، ثم انقل أنبوب الطرد الدقيق لتجفيف الثلج. العينة جاهزة الآن لاستخراج الحمض النووي الريبي. عند سحب غطاءين من العقد المعوية لكل عينة ، تم الحصول على أكثر من نانوغرام واحد من الحمض النووي الريبي ، وهو ما يكفي ل RNA-Seq ، وكان الحمض النووي الريبي ذا جودة ممتازة.

سلامة الحمض النووي الريبي للعينة المعروضة هي 8.3. كما تم جمع عينات بأرقام سلامة 7.5 و 6.9. في المجموع ، كان أكثر من 95٪ من جميع العينات المحضرة جيدة بما يكفي ل RNA-Seq.

تم تقييم جودة مجموعات بيانات RNA-Seq باستخدام خط أنابيب المعلوماتية الحيوية. يشير التحيز النهائي إلى أن العينات قد تم تسلسلها بنجاح وكان لها فقط تحيز متواضع ثلاثي الأطراف. يظهر مخطط النمط الحيوي الجيني أن نتائج التسلسل كانت متسقة إلى حد كبير.

بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لجمع التكرارات البيولوجية للحمض النووي الريبي من العقد المعوية ذات الجودة والكمية الكافية ل RNA-Seq في أقل من ثماني إلى 12 ساعة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تجميد عينات الأمعاء البشرية بشكل مسطح قدر الإمكان. سيضمن ذلك أنه يمكنك جمع مقاطع عرضية كبيرة جدا من العقد المعوية البشرية التي تتم معالجتها بسرعة وسهولة باستخدام التشريح المجهري بالليزر.