تقييم لوظيفة الكلي في نماذج الماوس من المرض الكبيبي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الكبيبات فيما يتعلق بالنمط الظاهري الوظيفي والهيكلي للكبيبة وتسمح بالتحليل الميكانيكي لأمراض الكلى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتكيف مع جميع النماذج المصنفة للأمراض الكبيبية. لتقييم نسبة الكرياتينين الألبومين البولي ، ضع فأر ذكر يبلغ من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع في قفص فأر استقلابي يحتوي على الماء وأطعمة حمية تخصيب في غرفة هادئة.

بعد ست ساعات ، أعد الفأر إلى مسكنه المعتاد واجمع ما لا يقل عن 50 ميكرولترا من عينة البول الأساسية من كل قفص ، وكرر جمع البول من مرة واحدة أسبوعيا إلى مرة واحدة شهريا. في نقطة النهاية التجريبية ، احصد الكلى من بطن كل واغسل الأعضاء في PBS البارد. لفحص الكبيبات القشرية ، قم بإزالة قطب واحد من قشرة الكلى وتقطيعه إلى قطع ملليمتر مكعب واحد.

لفحص الكبيبات المتجاورة العميقة ، قم بإزالة وتقطيع جزء صغير من النخاع إلى قطع ملليمتر مكعب واحد. بعد ذلك ، ضع الأجزاء من كل قسم من الأنسجة في قوارير مجهرية إلكترونية فردية تحتوي على خمسة ملليلتر من محلول الجلوتارالديهايد 2.5٪ وقم بتخزين العينات عند أربع درجات مئوية. بالنسبة لأنسجة الكبيبات القشرية والمجاورة ، قم بإزالة وإصلاح الثلث العلوي من الكلى في خمسة ملليلتر من 4٪ بارافورمالدهيد عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة.

بعد ذلك ، انقل الأنسجة الثابتة إلى خمسة ملليلتر من 70٪ من الإيثانول لمدة 24 ساعة قبل تضمينها في البارافين. للتحليل الكيميائي المناعي للكبيبات القشرية والنخاعية ، ضع ثلث الكلى في قالب الأنسجة واغمر الأنسجة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل. ثم ضع القالب على الثلج الجاف حتى يتجمد المركب وقم بتخزين العينات على حرارة 80 درجة مئوية حتى يتم تقسيمها.

لتحليل البروتين ، ضع ثلاث قطع من قشرة الكلى ثلاث × ملليمترين مكعبين في أنابيب بلاستيكية سعة 0.5 مليلتر وقم بتجميد العينات في النيتروجين السائل لتخزينها عند 80 درجة مئوية. لتخزين الأنسجة على المدى الطويل لتحليل الحمض النووي الريبي ، بعد التجميد المفاجئ ثلاث × قطعتين مكعبتين من الكلى كما هو موضح للتو ، أضف خمسة أحجام من محلول تثبيت RNase لتخزين 80 درجة مئوية. لعزل الكبيبات ، قم بتقطيع أنسجة الكلى المتبقية إلى شرائح وضع قطع الأنسجة في خمسة ملليلتر من محلول رنجر الثدييات المكمل بألبومين مصل البقر بنسبة 1٪ ، أو BSA ، على الجليد للغربلة الفورية.

لعزل الكبيبات ، قم بتكديس المناخل ذات أحجام مسام ميكرون تصاعدية على دورق زجاجي وضع شرائح الكلى على المنخل العلوي بحجم المسام 425 ميكرون. بعد ذلك ، استخدم مكبس حقنة ومحلول رنين ثديي مثلج طازج مكمل بنسبة 1٪ BSA لهرس أنسجة الكلى من خلال المنخل الأول. عندما يتم دفع أجزاء الكلى ، قم بإزالة المنخل العلوي واستمر في دفع شظايا الكلى عبر كل غربال بدوره.

عندما تبقى المناخل 100 و 70 ميكرون فقط ، انقل الحصاد الكبيبي الذي يحتفظ به آخر غربالين إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مع 10 ملليلتر من محلول جرس الثدييات الطازج المكمل بنسبة 1٪ BSA على الجليد. قم بتقسيم ثلاثة ملليلتر من تعليق الكبيبات بين أنبوبين من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مليلتر وحبيبات الكبيبات عن طريق الطرد المركزي. بعد إزالة المادة الطافية ، قم بتجميد الكبيبات في النيتروجين السائل لمدة 80 درجة مئوية لاستخراج البروتين والحمض النووي الريبي لاحقا.

بعد ذلك ، ضع محلول الكبيبات المتبقي في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية للحقن في جهاز نفاذية الماء الكبيبي على مرحلة المجهر الضوئي. عند التقاط كبيبة فردية سليمة ، حرر كبسولة بومان والشظايا الأنبوبية بواسطة ماصة دقيقة ، وابدأ في التسجيل ، وقم بنشر الكبيبة بمحلول رنين جديد مكمل بنسبة 1٪ BSA. بعد 30 ثانية ، قم بتبديل التعريج إلى محلول جرس BSA مركز بنسبة 8٪.

بعد 10 ثوان من التروية ، قم بتبديل التعفير مرة أخرى إلى محلول جرس BSA بنسبة 1٪ وأوقف التسجيل. للحصول على تصور مفصل للخلايا الكبيبية والمصفوفة المتبقية ، جفف عينات قشرة الكلى الثابتة المضمنة في البارافين عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، متبوعة بإزالة البارافين مع غمر الزيلين المتتالي والإيثانول التنازلي. أعد ترطيب العينات في الماء المقطر لمدة خمس دقائق واحتضان الشرائح في محلول حمضي دوري في خزانة دخانة.

بعد خمس دقائق ، اشطف الشرائح بثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في 100 مل من الماء المقطر ، تليها حضانة لمدة 15 دقيقة في كاشف شيف. في نهاية الحضانة ، اغسل الشرائح في ماء الصنبور الجاري لمدة خمس دقائق وقم بمقاومة البقع بالهيماتوكسيلين لمدة ثلاث ثوان قبل شطفها جيدا في ماء الصنبور الجاري لمدة 15 دقيقة أخرى. بعد ذلك ، قم بتجفيف الشرائح باستخدام غمر الإيثانول التصاعدي وغمرين متتاليين لمدة ثلاث دقائق.

بعد تجفيف الهواء ، يمكن تركيب الشرائح بوسيط تثبيت قائم على الزيلين لتقييم هيكلها الكبيبي على مجهر ضوئي بتكبير 400x. عامل النمو البطاني الوعائي ، أو VEGF-A ، تصاب الفئران بالضربة القاضية بالبيلة الزلالية التدريجية لمدة 10 أسابيع ، مقارنة بضوابط رفيق القمامة من النوع البري ، في حين أن الضربة القاضية VEGF165b المحمية من هذه الحالة. تتمتع الفئران بالضربة القاضية VEGF-A بنفاذية مائية كبيبية متزايدة بشكل كبير مقارنة بعناصر التحكم من النوع البري ، والتي يتم إنقاذها جزئيا عن طريق الإفراط في التعبير عن VEGF-A165b.

لا يكشف تلطيخ شيف الحمضي الدوري لأقسام قشرة الكلى في الفئران بالضربة القاضية VEGF-A عن أي تشوهات هيكلية كبيبية عن طريق تحليل المجهر الضوئي. ومع ذلك ، عند تحليل المجهر الإلكتروني ، تظهر الفئران بالضربة القاضية زيادة في عرض الغشاء القاعدي الكبيبي ، وانخفاض عدد القشرة البطانية ، وانخفاض تغطية مساحة الخلايا الفرعية ، وزيادة متوسط عرض شق الخلايا البودوية ، بينما ظل متوسط عدد الشقوق دون تغيير. الإفراط في التعبير عن VEGF165b في الضربة القاضية VEGF-A ينقذ التغييرات في الغشاء القاعدي الكبيبي وعرض الشق.

ومع ذلك ، فإن الإفراط في التعبير عن VEGF165b لا يؤثر على أرقام fenestrae المتغيرة أو تغطية مساحة الخلايا الفرعية. يؤكد الحمض النووي الريبي المستخرج من الكبيبات المنخلة تعبير VEGF165b mRNA البشري في VEGF165b المبالغ في التعبير عن الفئران بالضربة القاضية ، ويرتبط بانخفاض التعبير عن VEGFR2 في الفئران بالضربة القاضية VEGF-A التي تم إنقاذها عن طريق الإفراط في التعبير عن VEGF165b في الضربة في. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إكمال فحص الكلى الكامل لتقييم نموذج الفئران لمرض الكبيبات ، بما في ذلك تقييم نفاذية الكبيبات لكل من الألبومين والماء.