التحديد الكمي لاستعمار الكوليرا والإسهال في النموذج الزرد الكبار

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ضمة الكوليرا ، مثل كيفية استعمار ضمة الكوليرا في الساحل الهادئ وتتنافس مع الجراثيم المعوية لإنشاء مكانة مناسبة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الأسماك هي مضيف طبيعي للضمة الكوليرا حتى نتمكن من دراسة دورة حياة الكوليرا الضزامة الكاملة. سيوضح الإجراء Dhrubajyoti Nag ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري وبول برين ، طالب دكتوراه من مختبري.

بعد تحضير مزارع V.cholerae ، قم بتلقيح سمك الزرد بالغمر. أولا ، ضع أربعة أو خمسة من أسماك الزرد في دورق سعة 400 مل يحتوي على 200 مل من الماء المعقم. ثم أضف ملليلتر واحد من مزرعة V.cholerae لتركيز العدوى المطلوب.

ثم قم بتغطية الدورق بغطاء مثقوب. بعد تحضير جميع الأكواب ، انقلها إلى حاضنة أمامية زجاجية مثبتة على حرارة 28 درجة مئوية للتعرض المؤقت ، بعد حوالي ست ساعات ، اسكب ماء الدورق من خلال شبكة سمك لجمع الأسماك. يجب التخلص من المياه المصابة في المبيض لقتل البكتيريا.

ثم ضع السمك في 200 مل من ماء العدوى المعقم لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، قم بتشغيل هذا الماء عبر شبكة صيد السمك ، وتخلص من الماء في المبيض. الآن ، يمكن للأسماك أن تدخل في دورق نظيف جديد يحتوي على 200 مل من مياه العدوى المعقمة.

عندما تصل التجربة إلى نقطة النهاية المرجوة ، خذ عينة سعة 15 مليلتر من المياه المعدية لأغراض التشخيص. ثم اجمع الأسماك وتخلص من المياه المصابة بشكل مناسب. قم بتوجيه الجانب البطني لأعلى وقم بتأمين الجسم بدبوس من خلال الفك السفلي ودبوس آخر خلف فتحة الشرج.

زاوية كلا الدبابيس بعيدا عن الجسم. بعد ذلك ، امسح السطح البطني للأسماك بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم قم بتعقيم مشرط ومقص فاناس باستخدام 70٪ إيثانول ولهب.

الآن ، باستخدام المشرط ، قم بعمل شق صغير بالطول في البطن يخترق القشور ، ولكن فقط يقطع بعمق الجلد. بعد ذلك ، باستخدام المقص ، قم بتمديد الشق بعناية على طول الجسم ، مع قطع أعمق من مستوى الجلد. تجنب قطع فتحة الشرج.

ثم قم بعمل قطعتين جانبيتين باتجاه الرأس لتوسيع الفتحة. بعد ذلك ، قم بتثبيت الجلد على كل جانب من الشقوق الجانبية على سطح التشريح ، مع تحريك المسامير للخارج بعيدا عن الجسم. يجب أن يكون الجهاز المعوي مرئيا الآن كأنبوب رفيع جدا وشاحب.

الآن ، استخدم زوجين من الملقط المعقم باللهب لإزالة الأمعاء بأكملها بعناية والتي يمكن أن تكون هشة للغاية. انقل الأنسجة إلى أنبوب استشعار يحتوي على حبات زجاجية ومليلتر واحد من العازلة الباردة. بعد ذلك ، قم بتجانس الأنسجة كما هو موضح في بروتوكول النص وحدد مستويات الاستعمار المعوي.

بعد ذلك ، قم بعمل تخفيفات تسلسلية من تجانس الأمعاء والمخزن المؤقت. لكل سمكة ، قم بإعداد خمسة أو ستة تخفيفات بمقدار عشرة أضعاف في أحجام مليلتر واحد. دوامة أنابيب للخلط.

ثم ، قم بلوحة من 100 إلى 200 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح أجار LB التي تحتوي على الستربتومايسين و X-gal. احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة. بعد الحضانة الليلية ، عد مستعمرات V.cholerae على اللوحات.

هذه البكتيريا عادة مستعمرات زرقاء شاحبة على وسط LB مع X-gal. إذا لوحظت العديد من أشكال المستعمرات ، فقم بتصحيح عدد قليل من المستعمرات من كل شكل مختلف على لوحة TCBS مختلفة. في TCBS ، تنتج V.cholerae مستعمرات صفراء كبيرة ومسطحة قليلا مع مراكز غير شفافة وأطراف شفافة.

لتحديد مستويات الميوسين في إسهال الأسماك ، قم بإجراء اختبار على طبق 96 جيدا. في ثلاث نسخ ، قم بتحميل 100 ميكرولتر من المياه المعدية لكل حالة اختبار ، بما في ذلك فراغ ، في الآبار. بعد ذلك ، اخلطي 50 ميكرولترا من محلول الحمض الدوري الطازج بنسبة 0.1٪ في كل بئر اختبار.

استخدم سحب العينات للخلط. بعد ذلك ، لف الطبق بإحكام بالبلاستيك واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعة ونصف. بعد الحضانة ، قم بتبريد الطبق إلى درجة حرارة الغرفة.

في كل بئر ، أضف 100 ميكرولتر من محلول فوكسين واخلطه مع سحب العينات. الآن ، أعد لف اللوحة وضعها على الروك في درجة حرارة الغرفة. في حوالي 20 دقيقة ، اقرأ اللوحة على ارتفاع 560 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.

لتحديد التفاعل الناجم عن الميوسين في المحلول. لقياس مستويات البروتين في إسهال الأسماك ، استخدم مقايسة برادفورد. امزج 66 ميكرولترا من أحد معايير BSA أو 66 ميكرولترا من الماء المعدد مع 1,000 ميكرولتر من كاشف فحص برادفورد في كوفيت يمكن التخلص منه.

الآن ، احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ثم اقرأ الامتصاص عند 660 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي. مقياس بسيط لكمية الإسهال هو التعكر في الماء الذي يقاس عند 600 نانومتر.

اخلطي الماء جيدا ، أضيفي ملليلتر واحد إلى كوفيت يمكن التخلص منه وخذ القياس. للحصول على قياس فارغ أساسي ، استخدم ماء نظيف للعدوى. يمكن أيضا قياس بكتيريا V.cholerae المفرزة.

يمكن القيام بذلك مع الأسماك التي تم نقلها إلى المياه النظيفة بعد تلقيحها. قم بعمل تخفيفات تسلسلية لكمية من مياه الخزان كما هو موضح سابقا. ثم قم بوضع التخفيفات على وسائط انتقائية واحتضان الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

في وقت لاحق ، عد المستعمرات كما هو موضح سابقا ثم حدد CFU. تم تطعيم مجموعات من أسماك الزرد الموجودة في 200 مل من الماء بخمسة ملايين وحدة تشكيل مستعمرة من الكوليرا الوبائية. بعد ست ساعات في الماء الموبوء بالبكتيريا ، تنتقل الأسماك إلى الماء النظيف لمدة 18 ساعة.

ثم تم حصاد الأمعاء الهوائية. كانت كل سمكة تؤوي ما يقدر بنحو 100،000 إلى 1،000،000 خلية V.cholerae. تم استخدام المياه المعدية في فحوصات أخرى.

كانت مستويات الميوسين أعلى عندما كانت الجرعات المعدية أعلى. كان OD600 من الماء أعلى بشكل ملحوظ عندما أصيبت الأسماك ب V.cholerae. أخيرا ، كان مستوى البروتين الكلي في مياه الأسماك المصابة ما يقرب من ضعف المستوى الذي لوحظ في مياه الأسماك غير المصابة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إصابة أسماك الزرد البالغة بالكوليرا الضمة وتحديد الإسهال الناجم عن العدوى. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل فحوصات انتقال العدوى ، لتقييم إصابة الأسماك الساذجة بالأسماك المصابة سابقا.