Name: ورقة الضوء الفلورية الفحص المجهري لدراسة قلب مورين (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: اكتشف تقنية التصوير المجهري بورقة الضوء الفلورية لدراسة قلب الفأر وتأثيرات العلاج الجيني. تتيح هذه الطريقة رؤية سريعة للتغيرات الهيكلية القلبية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

المؤلفون يود أن يعرب عن امتنانه نغوين ثاو وناكانو أتسوشي من جامعة كاليفورنيا لتقديم نموذج الفئران للصورة. هذه الدراسة وأيده النجوم المنح HL118650 المعاهد الوطنية للصحة (إلى Tzung ك. هسياي)، HL083015 (إلى Tzung ك. هسياي)، HD069305 (لتشي جيم نون وهسياي ك. Tzung.)، HL111437 (إلى هسياي ك. Tzung وا. جيم تشي)، HL129727 (إلى Tzung ك. هسياي)، وجامعة تكساس نظام التمويل (جوهيون لي).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام الحيوانات بلجان المراجعة المؤسسية (إياكوك) في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجليس، كاليفورنيا.
1-تصوير نظام الإعداد
ملاحظة: انظر الشكل 1 و الشكل 2.
<ol><li>استرداد ليزر (CW) موجات مستمرة مع أطوال موجية 3: 405 نانومتر، 473 نانومتر، و 532 نانومتر. 2 مكان المرايا (M1 و M2) 150 مم أربا ومواءمتها مع طائراتهم مرآة في 45° إلى الشعاع. ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لإعادة توجيه الليزر بعيداً عن الإعداد الإضاءة الوجهين المزدوج. شعاع الناتجة ستكون في نفس اتجاه الشعاع الأولى.</li>
	<li>تمرير الحزم عن طريق قطرها 25 ملم حجاب القزحية/ثقب (PH)، مرشح كثافة محايدة قطرها 50 مم (الجبهة) مع مجموعة كثافة بصرية من 0-4.0، شعاع المتوسع (BE)، فتحه 30 ملم (S) مع العرض ~ 0-6 مم، ومرآة (م 3) ، جميعا في وضع 150 مم من بعضها البعض. مكان النسخة المتطابقة مع طائرتها مرآة في 45° إلى الشعاع.</li>
	<li>تمرير الحزمة من خلال وضع 150 مم من M3 الخائن شعاع 50: 50. ضع مرآة (M6) 150 مم من التقسيم شعاع ومحاذاته حيث يكون طائرتها مرآة في 45° للحزم التي تنبعث في الاتجاه إلى الأمام. استخدام شعاع ينعكس على تشكيل جانب واحد من الورقة المزدوجة-الإضاءة الخفيفة.</li>
	<li>ضع مرآة (M4) 150 مم من التقسيم شعاع ومحاذاته حيث يكون طائرتها مرآة في 45° إلى شعاع التي كانت تنبعث بزاوية 90 درجة من التقسيم شعاع. ضع مرآة ثانية (M5) 150 مم من M4 ومحاذاته حيث يكون طائرتها مرآة في 45° للشعاع المنعكس من M6. استخدام شعاع ينبعث من M5 لتشكيل الجانب الثاني من الورقة المزدوجة-الإضاءة الخفيفة.</li>
	<li>إعداد نظام الإضاءة الوجهين المزدوج بشكل متماثل (انظر الشكل 1). ضع عدسة أسطوانية واحدة (CL1) [قطر (د) = 1؛ البعد البؤري (f) = 50 مم] 150 مم تمشيا مع شعاع ينبعث من M5 على جانب واحد وآخر أسطواني متطابقة العدسة (CL2) 150 مم تمشيا مع شعاع ينبعث من M6 على الجانب الآخر من سيتو المزدوج-الإضاءة ضع ص 2 مرايا (M7 و M8) كل ما يتماشى مع عدسات أسطوانية على مسافات من 50 مم تعكس شعاع على 90 درجة.</li>
	<li>نموذج يبنوا متعامي من زوج من العدسات. وضع العدسة الأولى، L1 (د = 1؛ و = 100 ملم)، 100 ملم من M7، والعدسة الثانية، L2 (د = 1؛ و = 60 مم)، 160 مم من المستوى 1. كرر هذا على الجانب الآخر من ثنائي-الإضاءة مع عدسات متطابقة (L3, L4) وضعت نفس المسافة من M8.</li>
	<li>مكان المرايا، M9 و M10، 60 ملم من العدسات L2 و L4، على التوالي، وتمشيا مع الحزم. وضع أهداف الإضاءة، OL1 و OL2 (د = 2؛ و = 150 مم)، 150 مم من M9 و M10 وتمشيا مع الحزم. شعاع ينبعث من الأهداف تشكل الورقة الضوء للتصوير العينات.</li>
	<li>استخدام طابعة ثلاثية الأبعاد لطباعة صاحب العينة من ستايرين بوتادين أكريلونيتريل (ABS). تضمين قطعة من الزجاج غطاء [الانكسار (RI) = 1.4745] على كل جانب من الدائرة، عمودي على شعاع الإضاءة، التقليل إلى أدنى حد الانكسار غير متطابقة. مكان الدائرة بين الشعاع المنبعث من العدسات الهدف بالتساوي.</li>
	<li>تثبيت مجهر ستيريو مع 1 × الهدف التكبير وكاميرا أشباه الموصلات (سكموس) أكسيد معدن المتمم علمية عمودي على الإضاءة طائرة (انظر الشكل 2).</li>
</ol>2-تصوير نظام المعايرة
<ol><li>استرداد الخرز البوليسترين الفلورسنت التي 0.53 ميكرومتر في القطر.</li>
	<li>تحضير العينة حبة الفلورسنت بتمييع الحل حبة في حل مطابقة إنكسار (دواليب) مع 1% ذوبان منخفضة تأشير [اغروس] إلى 1:150، 000. قص قطعة من زجاج البورسليكات الأنابيب قطر داخلي 12 مم وقطر خارجي من 18 ملم بطول 30 مم. ملاحظة: يتم استخدام أنابيب زجاج البورسليكات لمطابقة الانكسار (1.47).</li>
	<li>يخلط عينة حبة المخفف 1% [اغروس] و "الماصة؛" الحل حبة/[اغروس] إلى أنابيب البورسليكات. يسمح [اغروس] ترسيخ في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية).</li>
	<li>ملء قاعة ABS (من الخطوة 1، 7) مع حل والغليسيرول 99.5%. وضع أنابيب زجاج البورسليكات يحتوي على الخرز داخل الدائرة. ضع الدائرة القيمة المطلقة في نظام التصوير حيث أنها في مركز شعاع غاوسي تم إنشاؤها بواسطة نظام الإضاءة المزدوجة.</li>
	<li>إرفاق مرحلة متعدية يجهز ثلاثي الأبعاد لأنابيب زجاج البورسليكات للسيطرة على الحركة والتوجه للعينة داخل قاعة ABS (انظر تكميلية الشكل 1).</li>
	<li>الحصول على الصور باستخدام الكاميرا سكموس بمعدل 30 إطار في الثانية (fps). باستخدام وحدة تحكم المحرك، نقل العينة 1 مم في الاتجاه الأفقي، والحصول على الصور في كل زيادة 1 ملم باستخدام الكاميرا سكموس. تستمر حتى قد تم تصويرها نموذج كامل.</li>
	<li>كومة الصور المكتسبة باستخدام برمجيات تصور (انظر الجدول للمواد). تقيس الدالة نقطة انتشار (PSF) للنظام باستخدام هذه الصور حبة. استخدام هذا PSF deconvolution أثناء معالجة في خطوات لاحقة الصور.</li>
</ol>3-نموذج إعداد
<ol><li>تشريح القلوب من ماوس نوع البرية P1 وماوس knockin ساركوليبين متخالف مزدوجة-لجنة المساواة العرقية مع الجين Rosa26-يفب (SlnCre/+؛ R26يفب مراسل/+) في P7. ملاحظة: أجرى القتل الرحيم باستخدام بينتوباربيتال والأسلوب الذي وصفته روبنز et al. 10-وأجرى التشريح وفقا للأسلوب الذي وصفته10،الوطني للقلب والرئة والدم معهد (NHLBI)11.</li>
	<li>أداء مادة كيميائية تطهير قلوب موريني كما وصفها سونغ كيفن et al. 12. ملاحظة: يجب أن تقوم بالخطوات التالية في غطاء دخان أن المواد الكيميائية المستخدمة مواد سامة.<ol>
<li>شطف القلوب في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) 3 x لمدة 10 دقائق. بعد الشطف، ضع القلوب في حل بارافورمالدهيد 4% واحتضان هذه العينات في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.</li>
		<li>وضع العينات في محلول اكريلاميد 4% يحتوي على 0.5% w/v من 2، 2 '--أزوبيس هيدروكلوريد. تسمح العينات لاحتضانها في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. وبعد الاحتضان بين عشية وضحاها، إزالة العينات واحتضانها لهم في 37 درجة مئوية ح 2-3.</li>
		<li>شطف العينات مع برنامج تلفزيوني وثم وضعها في محلول 8% w/v دوديسيل كبريتات الصوديوم وحمض البوريك 1.25% w/v. احتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية حتى هم واضحة. وهذا يمكن أن يستغرق عدة ساعات تبعاً لسمك العينة. بعد تطهير، إزالة العينات ووضعها في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة لمدة يوم واحد.</li>
		<li>إعداد إنكسار مطابقة الحل مع 40 غ من كثافة النطاق المتوسط التدرج (انظر الجدول للمواد) في 30 مل م 0.02 الفوسفات المخزن المؤقت (PB)، 0.1% % توين-20، و 0.01 أزيد الصوديوم. تقديم الحل للرقم الهيدروجيني 7.5 مع هيدروكسيد الصوديوم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ضع العينة تم مسحها في دواليب مع الانكسار من 1.46-1.48 و 1% [اغروس]. إدراج النموذج في أنابيب زجاج البورسليكات والسماح [اغروس] ترسيخ في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية).</li>
	<li>إرفاق مرحلة متعدية يجهز ثلاثي الأبعاد لأنابيب زجاج البورسليكات للتحكم في الحركة والتوجه للعينة ضمن ثلاثي الأبعاد طباعة الدائرة ABS (انظر تكميلية الشكل 1).</li>
</ol>4-تصوير القلب الكبار
<ol><li>حقن 8.7 × 1012 فيروسات من نوع الفيروس المرتبط بالغدة ناقلات 9 (AAV9) يحتوي على مروج خاصة بالقلب تروبونين تي (كتنت) والبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في وحدة تخزين 100 ميكروليتر في هذا السياق ذيل ماوس نوع البرية 2-شهر (C57BL/6). ملاحظة: وضعت في AAV9 وفقا للأسلوب الموصوفة بيوان et al. 13-وهذا يتسبب في التجارة والنقل لربط قناة البوتاسيوم النخاع الخارجي الكلي (رومك) إنتاج AAV9-كتنت-رومك-التجارة والنقل (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>تشريح قلوب الماوس الكبار في سن وفقا للأسلوب الذي وصفته NHLBI11أشهر 7.5. إعداد العينات باستخدام الخطوات 3.1-3.3.</li>
	<li>قم بتوصيل وحدة تحكم المحرك صمام المحرك. إرفاق صمام أنابيب زجاج البورسليكات للتحكم في الحركة واتجاه العينة ضمن ثلاثي الأبعاد طباعة الدائرة ABS.</li>
	<li>وضع العينة بحيث أنها في مركز شعاع غاوسي تم إنشاؤها بواسطة نظام الإضاءة المزدوجة. الحصول على الصور باستخدام الكاميرا سكموس بمعدل 100 في الثانية.</li>
	<li>باستخدام وحدة تحكم المحرك، نقل العينة 1 ملم باتجاه محوري، والحصول على الصور في كل زيادة 1 ملم مع الكاميرا سكموس. تستمر حتى قد تم تصويرها نموذج كامل. ملاحظة: النظام يسيطر برمجيات المتقدمة المخصصة لمراقبة صك.</li>
	<li>كومة الصور المكتسبة باستخدام برمجيات تصور (انظر الجدول للمواد). وضع صور ثلاثية الأبعاد باستخدام هذه رصات الصور و البرمجيات التصور14. ديكونفولفي PSF من الخطوة 2.6 مع مكدس الصورة المكتسبة. تعيين قيمة بكسل كثافة عتبة احترام ملامح القلب وإضافة الألوان الزائفة للصور استناداً إلى هذه الكثافة تدرج رمادي.</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li>
<li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li>
<li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209(2017).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+excision+of+murine+aorta%3B+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).</li>
<li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://community.parentprojectmd.org/profiles/blogs/standard-operating-procedures-for-duchenne-animal-models">Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models</a>. , (2015).</li>
<li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736(2016).</li>
<li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li>
<li>FEI, <a target="_blank" href="https://www.fei.com/software/amira-user-guide/">Amira User's Guide</a>. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

نظام لسفم والأسلوب الموصوفة هنا يستخدم شعاع إضاءة الوجهين المزدوج جنبا إلى جنب مع تطهير ضوئية للصورة قلب الماوس في مراحل ما بعد الولادة والكبار من تطورها. شعاع إضاءة تقليدية واحد يعاني من تشتت فوتون والاستيعاب من خلال عينات الأنسجة أكثر سمكا وأكبر1،3. توفر عوارض الوجهين المزدوج إضاءة حتى أكثر من العينة، وبالتالي تقليل تأثير شريطية وغيرها من الأعمال الفنية التي غالباً ما ينظر في الصور التي تنتجها إضاءة أحادية الجانب. هذه التقنية أيضا زيادة حجم العينة التي يمكن تصو...

مجهرية الفلورية الضوء-ورقة تقنية وضعت في بادئ الأمر في عام 1903 ويستخدم اليوم كطريقة لدراسة التعبير الجيني وأيضا لإنتاج نماذج ثلاثية الأبعاد أو 4-د من الأنسجة العينات1،،من23. يستخدم هذا الأسلوب التصوير ورقة رقيقة من الضوء لإضاءة طائرة واحدة من عينة حيث أن فقط تلك الطائرة يتم التقاطها بواسطة الجهاز. يمكن ثم نقل العينة باتجاه المحوري لالتقاط كل طبقة، قسم واحد في كل مرة، وتقديم نموذج ثلاثي الأبعاد بعد تجهيز الصور المكتسبة4. ومع ذلك، نظراً لامتصاص وتشتت الفوتونات، كانت محدودة للعينات التي تكون أما بضعة ميكرونات سميكة أو شفافة بصريا1لسفم.
وأدت القيود المفروضة على لسفم لدراسات مستفيضة للكائنات التي لها الأنسجة التي تكون شفافة بصريا، مثل الزرد. غالباً ما تجري دراسات شملت التنمية القلب والتمايز الزرد أن هناك جينات المصانة بين البشر والزرد5،6. على الرغم من أن هذه الدراسات أدت إلى التقدم في مجال أبحاث أمراض القلب المتصلة بالقلب6،7، لا تزال هناك حاجة إجراء بحوث مماثلة على الكائنات ذات مستوى أعلى مثل الثدييات.
أنسجة القلب الثدييات تحديا نظراً لسمك والتعتيم للأنسجة، الاستيعاب سبب الهيموغلوبين في خلايا الدم الحمراء، وشريطية الذي يحدث بسبب الإضاءة على وجه واحد من العينة تحت الأساليب التقليدية في لسفم1 , 8-للتعويض عن هذه القيود، اقترحنا على استخدام الإضاءة الوجهين المزدوج ونسخة مبسطة من تقنية الوضوح9 جنبا إلى جنب مع إنكسار مطابقة الحل (دواليب). ولذلك، يسمح هذا النظام لتصوير عينة التي أكبر من 10 × 10 × 10 ملم3 في حين الحفاظ على قرار ذات نوعية جيدة في محوري والأفقي طائرات8.
أولاً معايرة هذا النظام استخدام الخرز الفلورسنت مرتبة في تكوينات مختلفة داخل أنابيب زجاجية. ثم، استخدم النظام لصورة قلوب مورين بعد الولادة والكبار. أولاً، تم تصويرها قلب الماوس بعد الولادة في 7 أيام (P7) للكشف عن تجويف البطين، وسمك جدار البطين وهياكل صمام، ووجود ترابيكوليشن. ثانيا، أجريت دراسة لتحديد الخلايا التي تفرق في cardiomyocytes باستخدام قلب ماوس بعد الولادة في اليوم 1 (P1) مع لجنة المساواة العرقية المسمى كارديوميوسيتيس وبروتين فلوري الصفراء (يفب). وأخيراً، تم تصويرها الفئران الكبار في أشهر 7.5 مراعاة وجود البوتاسيوم النخاع الخارجي الكلي قنوات (رومك) بعد العلاج الجيني8.

<table><tbody><tr><td>CW Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LMM-GBV1-PF3-00300-05</td><td>إثارة الفلوروفورات</td></tr><tr><td>مرشح الكثافة المحايدة</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td><td>يتحكم في كمية الضوء الداخلة إلى النظام</td></tr><tr><td>موسع شعاع لوني</td><td>Thorlabs</td><td>GBE05-A</td><td>يوسع شعاع الضوء</td></tr><tr><td>الشق الميكانيكي</td><td>Thorlabs</td><td>VA100C</td><td>يتحكم في عرض الشعاع</td></tr><tr><td>مقسم الشعاع</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td>يشكل شعاع إضاءة مزدوج</td></tr><tr><td>مجهر ستيريو مع عدسة موضوعية 1X</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>تستخدم لمراقبة عينة</td></tr><tr><td>كاميرا ORCA-Flash4.0 LT sCMOS</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>تستخدم لالتقاط الصور</td></tr><tr><td>أكريلونيتريل بوتادين ستايرين (ABS)</td><td>Stratasys</td><td>uPrint</td><td>المواد المستخدمة لطباعة حامل عينة ثلاثية الأبعاد</td></tr><tr><td>حبات البوليسترين الفلورية</td><td>Spherotech Inc</td><td>PP-05-10</td><td>تستخدم لمعايرة نظام التصوير</td></tr><tr><td>أنابيب زجاجية من البورسليكات</td><td>Corning</td><td>Pyrex 7740</td> أنابيب <td>لتضمين العينة</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td>تعبئة لغرفة العينة</td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td> محلول <td>شطف لقلوب الفئران</td></tr><tr><td>علوم المجهر الإلكتروني</td> <td>بارافورمالديهايد</td><td>RT-15700</td><td>محلول الحضانة الأول</td></tr><tr><td>أكريلاميد</td><td>واكو للكيماويات</td><td>AAL-107</td><td>ممزوج ب 2،2 '-Azobis dihydrochloride لحل الحضانة الثاني لقلوب الفئران</td></tr><tr><td>2،2 '-Azobis dihydrochloride</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td>ممزوج بمادة الأكريلاميد لحل الحضانة الثاني لقلوب الفئران</td></tr><tr><td>كبريتات دوديسيل الصوديوم&nbsp;</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>71725</td><td>ممزوج بحمض البوريك لمحلول الحضانة الثالث لقلوب الفئران حمض</td></tr><tr><td>البوريك</td><td>فيشر Scientific</td><td>A74-1</td><td>ممزوج بكبريتات دوديسيل الصوديوم لمحلول الحضانة الثالث لقلوب الفئران</td></tr><tr><td>Sigma D2158</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158</td><td>ممزوج ب PB و Tween-20 و Sodium azide كمحلول مطابق لمعامل الانكسار</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11332465001</td><td>ممزوج مع Sigma D2158 و PB و Sodium azide كمحلول مطابق لمعامل الانكسار</td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>ممزوج مع Sigma D2158 و PB و Tween-20 كمحلول مطابق لمعامل الانكسار</td></tr><tr><td>ناقلات الفيروس 9 مع محفز Troponin T الخاص بالقلب الموسومة ب GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>VB2045</td><td>يعبر عن GFP عند ربطه بمشغل محرك سيرفو ROMK</td></tr><tr><td>DC</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>تستخدم لحركة العينة في الاتجاه المحوري داخل الورقة الخفيفة</td></tr><tr><td>K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>يتصل بمشغل المحرك ويتحكم في حركة المشغل</td></tr><tr><td>برنامج Amira</td><td>FEI</td><td>Software N / A</td><td>لإنتاج صور ثنائية الأبعاد و 3-D</td></tr></tbody></table>

ورقة الضوء الفلورية الفحص المجهري لدراسة قلب مورين

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

الفلورية الضوء-ورقة الفحص المجهري تستخدم على نطاق واسع للحصول على الصور السريع مع ارتفاع قرار محوري من ميكرومتر إلى مقياس ملليمتر. التقنيات التقليدية للضوء--ورقة تنطوي على استخدام شعاع واحد الإضاءة الموجهة أورثوجونالي في عينة الأنسجة. صور لعينات كبيرة التي يتم إنتاجها باستخدام شعاع إضاءة واحدة تحتوي على تخطيطات أو التحف ويعانون من قرار تخفيض بسبب تشتت وامتصاص الضوء بواسطة الأنسجة. تستخدم هذه الدراسة شعاع إضاءة الوجهين المزدوج ومبسطة وضوح بصري مسح تقنية لقلب مورين. هذه التقنيات تسمح لتصوير أعمق عن طريق إزالة الدهون من القلب وإنتاج حقل كبير من التصوير، وأكبر من 10 × 10 × 10 ملم3. ونتيجة هذه الاستراتيجية تمكننا من قياس أبعاد البطين وتتبع نسب أمراض القلب، وتعريب التوزيع المكاني للبروتينات الخاصة بالقلب وقنوات أيون من بعد الولادة إلى قلوب الكبار الماوس مع تباين كافي و القرار.

الأسلوب الموصوفة هنا يستخدم شعاع إضاءة الوجهين المزدوج جنبا إلى جنب مع تطهير عينات أنسجة القلب الماوس ضوئية لتحقيق عمق تصوير أعمق وأكبر حجم تصوير مع القرار التصوير كافية (الشكل 1). لمعايرة النظام، وضعت الخرز نيون داخل أنابيب زجاجية ومن خلال نظام التصوير. ثم تصويرها الخرز وتصور في الطائرة x-y, y-z الطائرة، وفي الطائرة x-z، الحصول على النقطة نشر الدالة (PSF) لنظام8. معايرة نظام أصدر قرارا في الاتجاه الأفقيالأفقي د ≈ 2.8 ميكرون...

هذه الدراسة يستخدم تقنية مجهرية () ورقة الضوء فلورية إضاءة الوجهين المزدوج جنبا إلى جنب مع مسح بصري لدراسة قلب موريني.

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

الميزة الرئيسية لهذه التكنولوجيا هي أنها تسمح للتصوير السريع لأي قلب الماوس. ويمكن استخدامه لمراقبة وجود قنوات الهواء بعد العلاج الجيني. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في أمراض القلب التنمية، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى، مثل علم الأعصاب والبولون.عموما، سوف الأفراد النضال مع هذه التقنية لأن تركيب التصوير لقلب الماوس الكبار يمكن أن يكون صعبا، وانها مختلفة عن غيرها من التقنيات التقليدية، مثل المجهر confocal والمقلوب. ضع ليزر الموجة المستمرة مع ثلاثة أطوال موجية من 405 نانومتر و 473 نانومتر و 532 نانومتر. ثم، الصق مرآة واحدة ومحاذاتها مع مستوى المرآة عند 45 درجة إلى الشعاع.هذا سيوجه الليزر نحو الفاصل شعاع، الذي يشكل الإعداد الإضاءة مزدوجة الجانب. بعد ذلك، تمرير شعاع من خلال مرشح كثافة محايدة قطرها 50 ملليمتر، وموسع شعاع، وثقب دبوس قطرها 25 ملليمتر، وكلها متمركزة 150 ملليمتر من بعضها البعض. مرر الشعاع من خلال مقسم شعاع 50-50، وضعت 150 ملليمتر من الثقب.بعد ذلك، ضع مرآة 150 ملليمتر من مقسّم الشعاع، عند 90 درجة إلى الشعاع الأمامي، ومحاذاته بحيث يكون مستوى المرآة عند زاوية 45 درجة للشعاع. ثم، ضع مرآة ثلاثة 100 ملليمتر من المرآة الثانية، ومحاذاة بحيث انها مرآة الطائرة هو في زاوية 45 درجة إلى شعاع ينعكس من مرآة اثنين. استخدم هذا الشعاع المنعك لتشكيل جانب واحد من ورقة الإضاءة المزدوجة.على الجانب البعيد من الفاصل شعاع، مكان مرآة خمسة بحيث انها مرآة الطائرة هو في 45 درجة إلى شعاع الذي ينبعث في اتجاه أمامي. استخدام شعاع المنبعث من مرآة خمسة لتشكيل الجانب الثاني من ورقة الإضاءة المزدوجة الخفيفة. بعد ذلك، قم بإعداد نظام الإضاءة المزدوجة الجانب بطريقة نظامية.ضع العدسة الأسطوانية اثنين 150 ملليمتر بعيدا عن المرآة ثلاثة، وآخر عدسة أسطوانية متطابقة 150 ملليمتر بعيدا عن مرآة خمسة، على الجانب الآخر من الإعداد الإضاءة المزدوجة. بعد ذلك، ضع مرآتين، كل منها متماشياً مع العدسات الأسطوانية، على مسافات 50 ملليمتراً لتعكس الشعاع عند 90 درجة. على جانبي ورقة الضوء، تشكل مزدوجة اللونية من زوج من العدسات، مع العدسة الأولى يجري وضع 100 ملليمتر من المرآة السابقة، وبعد أن قطر بوصة واحدة و طول بؤري من 100 ملليمتر.يجب وضع العدسة الثانية 160 ملليمتر من العدسة واحدة ، مع قطر بوصة واحدة ، وطول بؤري من 60 ملليمترا. ثم، ضع أهداف الإضاءة واحد واثنين 150 ملليمتر من المضاعفة اللونية السابقة، بحيث تكون في خط مع شعاع. يشكل الشعاع المنبعث من الأهداف ورقة الضوء لتصوير العينات.أولاً، إعداد عينة حبة الفلورسنت عن طريق تمييع محلول حبة ميكرومتر 0.53، من واحد إلى 150،000، في محلول مطابقة معامل الانكسار قبل تسخينها، مع واحد في المئة منخفضة تذوب مشيرا agarose. بعد ذلك، استخدم قطعة من أنابيب الزجاج البورسليكات مع قطر داخلي من 12 ملليمتر، وقطر خارجي من 18 ملليمتر، إلى طول 30 ملليمتر. الميبت الحل agarose حبة في أنابيب البورسليكات والسماح لأغاروز لترسيخ في درجة حرارة الغرفة.الآن، ملء غرفة ABS المطبوعة ثلاثية الأبعاد مع حل gylcerol بنسبة 99.5 في المائة. وضع أنابيب الزجاج borosilicate، التي تحتوي على الخرز، داخل الغرفة. إرفاق مرحلة تحويلية ثلاثية الأبعاد بمحركات إلى أنابيب زجاج البورسليكات للتحكم في حركة واتجاه العينة داخل غرفة ABS.ثم، استخدم برامج مصممة خصيصا للحصول على الصور باستخدام كاميرا sCMOS، بمعدل 30 لقطة في الثانية. باستخدام وحدة تحكم المحرك، حرك العينة ملليمتر واحد في الاتجاه الجانبي، والحصول على الصور في كل زيادة ملليمتر واحد، حتى تم تصوير العينة بأكملها. كومة الصور المكتسبة باستخدام برنامج مرئي، وقياس وظيفة انتشار نقطة من النظام باستخدام هذه الصور حبة.استخدم محلول مطابقة لمؤشر الانكسار، مع الرقم الـ 7.5، واذاب واحد بالمائة من الأكروز في محلول المطابقة. ضع عينة قلب فأرة بالغة واضحة في محلول مطابقة مؤشر الانكسار ، مع واحد في المئة agarose حل. ثم، أدخل العينة في أنابيب الزجاج البورسليكات، والسماح لأاغروز لترسيخ في درجة حرارة الغرفة.إرفاق مرحلة تحويلية ثلاثية الأبعاد بمحركات إلى أنابيب زجاج البورسليكات للتحكم في حركة واتجاه العينة داخل غرفة ABS مطبوعة ثلاثية الأبعاد. ضع العينة بحيث تكون في وسط الشعاع الغاوسي ، الذي تم إنشاؤه بواسطة نظام الإضاءة المزدوج. ثم، تعيين معدل اقتناء الكاميرا sCMOS إلى 30 لقطة في الثانية.الآن، باستخدام وحدة تحكم المحرك، حرك عينة ملليمتر واحد في الاتجاه المحوري والحصول على الصور في كل زيادة ملليمتر واحد. استمر حتى يتم تصوير النموذج بأكمله. قم بتكديس الصور المكتسبة باستخدام برنامج مرئي.قم بتطوير الصور ثلاثية الأبعاد باستخدام رصة الصور هذه. لتحقيق ذلك ، deconvolve وظيفة انتشار نقطة محددة مسبقا ، واستخدامها للحصول على كومة الصورة المكتسبة. وأخيراً، قم بتعيين قيمة كثافة عتبة البكسل لمراقبة ملامح القلب، وإضافة لون زائف إلى الصور، استنادًا إلى هذه الكثافة الرمادية.في اليوم واحد بعد الولادة، يمكن للمرء أن تصور الصمامات، الأذين، البطين، العضلات البكتين، وtrabeculation، من بين ميزات أخرى. في اليوم السابع بعد الولادة، تكون الميزات أكثر تحديدًا. الأذين، البطين، أبعاد تجويف البطين، وسمك جدار البطين كلها واضحة.لدراسة تمايز cardiomyocyte داخل القلب ، تم تسمية الفئران heterozygous في وضع العلامات لإظهار cardiomyocytes. تظهر الخلايا المسماة هنا، في كل اتجاه من اتجاه الطائرة. تم دمج الطائرات الثلاث، لخلق تقديم 3-D من القلب.المنطقة الحمراء الدائرة داخل inset يظهر اثنين من قلوب الماوس شفافة بعد خضوعه تقنية وضوح ويجري إدراجها في أنابيب الزجاج borosilicate. بالإضافة إلى دراسة الفئران بعد الولادة، يمكن استخدام نظام التصوير أيضًا لدراسة قلب الفأر البالغ. هنا، يتم عرض قنوات ROMK الموسومة من GFP في 7.5 أشهر.وُجدت هذه الذّات بشكل رئيسي في جدار البطين. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الأسلوب في دقيقة إلى دقيقتين. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم إزالة جميع الفقاعات حول العينة في الأنبوب.يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل تجزئة تكدس الصور تلقائيًا، للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بإصابة القلب والأوعية الدموية والتجدد. بعد تطورها ، استخدم الباحثون هذه التقنية لدراسة هندسة القلب في مراحل النمو بعد الولادة والبالغين في الفئران.

light-sheet-fluorescence-microscopy-for-the-study-of-the-murine-heart

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

في القلب، والأحداث الجزيئية تنسيق وظيفة الكهربائية ومقلص من الجهاز. وهناك مجموعة من تقنيات المجهر مضان ميدانية محلية المعروضة هنا يمكن تسجيل المتغيرات الخلوية في قلوب سليمة. تحديد آليات تحديد وظيفة القلب أمر بالغ الأهمية في فهم الكيفية التي يعمل بها القلب في حالات المرضية.

محلي الميدان مضان المجهر: التصوير الإشارات الخلوية في قلوب سليمة

هنا، ونحن تصف نهج ورقة المجهر الضوئي لتصور القلب CD45 + الكريات البيض التسلل في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم العقيم، والذي يسببه العلاج داخل الخناق السموم علاج الفئران CD11c.DTR.

التصور الكمي من التسلل الكريات البيض في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم من قبل ورقة ضوء المجهري

نقدم هنا، بروتوكولا لتصور وضع القلوب في الزرد في 4-الأبعاد (4-د). تصوير 4-د، عبر ورقة الضوء الفلورية مجهرية ()، يأخذ 3 الأبعاد (3-D) الصور على مر الزمن، لإعادة إعمار قلوب النامي. نعرض كيفا وكما أن إجهاد القص ينشط الشق للوفلر إشارات من خلال دائرة التنمية، الذي يشجع ترابيكوليشن القلب.

مجهرية Fluorescence ورقة الضوء لالتقاط الصور 4-الأبعاد من آثار تحوير إجهاد القص في قلب الزرد النامي

نحن نصف الأدوات المحسنة لدراسة قلب حمار وحشي في الجسم الحي مع المجهر مضان ورقة الضوء. على وجه التحديد، نقترح خطوط القلب المعدلة وراثيا مشرق وتقديم تقنيات جديدة لطيف تضمين وشل الحركة التي تجنب عيوب النمو والقلب. كما يتم توفير خط أنابيب محتمل للحصول على البيانات وتحليلها يتكيف مع تصوير القلب.

المجهر ورقة خفيفة من ديناميات القلب السريع في أجنة حمار وحشي

نبلغ عن طريقة لإعادة البناء الميزوسكوبي لقلب الفأر بالكامل من خلال الجمع بين التطورات الجديدة في تحويل الأنسجة وتلطيخها مع تطوير مجهر ورقة ضوئية ممسوحة محوريا.

التصوير البصري بالمنظار لقلب الفأر بالكامل

يوضح هذا البروتوكول العزل الموجه بالفحص المجهري وتلطيخ الأوردة الرئوية للفئران. نقوم بإعداد عينات الأنسجة التي تحتوي على الأذين الأيسر والأوردة الرئوية والرئتين المقابلة وتلطيخها لقلب Troponin T و Connexin 43.

التشريح المجهري وتلطيخ التألق المناعي لأكمام عضلة القلب في الأوردة الرئوية للفئران

يستخدم البروتوكول الفحص المجهري المتقدم للصفائح الضوئية جنبا إلى جنب مع طرق إزالة الأنسجة المكيفة للتحقيق في الهياكل القلبية المعقدة في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لفهم تشكل القلب وإعادة تشكيله.

التصوير بالضوء للكشف عن بنية القلب في قلوب القوارض

تتيح إعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D) لتلف القلب في احتشاء عضلة القلب الحاد (repAMI) القياس الكمي المخلص والتحديد المشترك للأنماط المرتبطة بالأمراض المصاحبة. هنا ، يتم توفير نهج تصوير موجه بورقة ضوئية آلي للقياس المعاصر لتلف القلب والمنطقة المعرضة للخطر واستجابة الخلايا المناعية.

تحليل ثلاثي الأبعاد متزامن لتلف القلب والاستجابة المناعية في احتشاء عضلة القلب الحاد المتكرر باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية

وقد تم تصميم مفاعل حيوي قادر على الضغط دوري تعريض أنسجة القلب صمام ضغط الظروف الفسيولوجية والمرضية. برنامج يتيح للمستخدمين ابفيو (LabVIEW) للسيطرة على ضغط حجم والسعة والتردد. ويمكن استخدام هذا الجهاز لدراسة mechanobiology من نسيج صمام القلب او خلايا معزولة.

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

يوصف منهجية لتقدير توجهات الألياف البطين من الصور في الجسم الحي من قلب المريض هندستها لنمذجة الشخصية. المصادقة على منهجية تنفيذها باستخدام العادية وعدم قلوب الكلاب إثبات أن عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين اتجاهات الألياف يقدر وحصلت على مستوى ملاحظتها سريريا.

المريض محددة النمذجة من القلب: تقدير توجهات الألياف البطيني

اكتشف تقنية التصوير المجهري بورقة الضوء الفلورية لدراسة قلب الفأر وتأثيرات العلاج الجيني. تتيح هذه الطريقة رؤية سريعة للتغيرات الهيكلية القلبية بدقة عالية.

ورقة الضوء الفلورية الفحص المجهري لدراسة قلب مورين

استكشف المزيد من الفيديوهات