تحديد نوع الخلايا العصبية مع أوبترودي زجاج في الفئران مستيقظا أوبتوجينيتيكس

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل وظائف أنواع مختلفة من الخلايا العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تجعل من الممكن تحديد الأنواع المختلفة من الخلايا العصبية في الجسم الحي بشكل موثوق باستخدام مواد غير مكلفة ويمكن الوصول إليها. سأعرض الإجراء مع شينجي موراموتو ، الفني لدينا ، وللانلان ما ، أستاذنا المساعد من مختبرنا.

لبدء هذا الإجراء ، اسحب الأنبوب الفولاذي برفق للتحكم في الضغط من برميل الحامل. قم بتوسيع فتحة جانب مقعد الدبوس في برميل الحامل عن طريق الحفر. ثم ضع أنبوبا من الفولاذ المقاوم للصدأ في الحفرة.

بعد ذلك ، أدخل غلاف تزاوج سيراميك لطويق قطره 2.5 ملم في الحفرة. اصنع ثقبا في أرنب على شكل حرف L وقم بتوصيل برميل حامل القطب بالأرنب باستخدام مادة لاصقة إيبوكسي. بعد ذلك ، قم بتثبيته على مناور بمسامير.

قم بإعداد عمود رأس مصمم خصيصا عن طريق جعل فاصل لوحة الدوائر العمودية في شكل متوازي المستطيلات باستخدام قاطع طحن ، وقم بتقطيعه إلى عمودين للرأس بمنشار. ثم قم بتسطيح الجزء السفلي من عمود الرأس باستخدام قاطع الطحن. قبل الجراحة ، قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية وعمود الرأس باستخدام الأوتوكلاف.

نظف الإطار التجسيمي ووسادة التسخين بنسبة 70 بالمائة من الكحول. بعد ذلك ، قم بتخدير الماوس ووضعه في الإطار التجسيمي على وسادة التدفئة. في هذه التجربة ، يتم استخدام فأر معدل وراثيا يتم فيه استخدام الخلايا العصبية المثبطة التي تعبر عن channelrhodopsin-II.

ضع الأسنان في فتحة شريط العض وشد مشبك الأنف برفق. بعد ذلك ، قم بإصلاح جانبي الرأس باستخدام قضبان الأذن. عندما يتم تثبيت الرأس بشكل صحيح بواسطة قضبان الأذن ، شد مشبك الأنف.

ضع مرهما للعيون على العينين. قم بقص الشعر فوق الرأس بمقص صغير ونظف فروة الرأس بقطعة قطن من غلوكونات الكلورهيكسيدين. ثم اقطع فروة الرأس على طول خط الوسط وادفعها جانبا.

قم بإزالة السمحاق بقطعة قطن مغموسة في 70 في المائة من الكحول واترك الجمجمة تجف. ثم قم بإرفاق عمود الرأس بالمناور. ضع عمود الرأس بشكل مسطح على الجمجمة حول بريجما باستخدام المعالج.

اخلطي أربع قطرات من المونومر ، وقطرة واحدة من المحفز ، وملعقة صغيرة صغيرة من البوليمر في طبق صغير مبرد في الثلاجة. ضع الأسمنت السني على العظم الأمامي والجداري وثبت عمود الرأس على الجمجمة. بعد أن يصلب الأسمنت السني ، قم بإزالة الماوس من الإطار التجسيمي.

ضع مرهما مضادا حيويا على الجلد المكشوف وحقن مزيجا من مضاد ميديتوميدين والمضادات الحيوية. ثم ضع الماوس على وسادة الحرارة في قفص حتى يستيقظ وأعده إلى قفص سكني مع التخصيب. لإجراء حج القحف فوق منطقة الدماغ المستهدفة للتسجيل، نظف الجمجمة بقطعة قطن مبللة بغلوكونات الكلورهيكسيدين والكحول بنسبة 70 في المائة.

اكشط الجمجمة بعناية فوق موقع التسجيل باستخدام مثقاب الأسنان. عندما يكون العظم رقيقا بدرجة كافية ، اقطعه بطرف المشرط وقم بإزالته. ثم ضع أسمنت الأسنان حول المنطقة المكشوفة لتقوية الجمجمة.

قم بتغطية منطقة الدماغ المكشوفة بمادة لاصقة من السيليكون بعد أن يصلب الأسمنت الأسنان. ثم ضع على وسادة الحرارة في قفص حتى يستيقظ ، ثم أعده إلى قفص سكني. اسمح للحيوان بالتعافي لمدة يوم واحد على الأقل بعد بضع القحف ، قبل إجراء التسجيل الفيزيولوجي الكهربي.

قبل إجراء التسجيل الفيزيولوجي الكهربي، قم بعمل بعض الماصات الزجاجية من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب القطب. املأ الماصات ب 10 مللي مولار PBS. في بعض التسجيلات ، تتم إضافة اثنين بالمائة من النيوروبيوتين إلى 10 مللي مولار PBS.

بعد ذلك ، ضع في غرفة التسجيل. قم بتوصيل ماصة زجاجية مملوءة بحامل المرجع الجاهز المصنوع خصيصا. أدخل سلكا مطلي بكلوريد الفضة في الماصة الزجاجية.

بعد ذلك ، قم بتوصيل الدبوس بمرحلة رأس مضخم التسجيل. بعد ذلك ، قم بتوصيل سلك تصحيح الألياف الضوئية بحلقة زركونيا بغلاف التزاوج المنفصل على حامل المرجعية. ادفع سلك التصحيح في الغلاف حتى يلامس طرف الطويق الجزء الخلفي من الماصة الزجاجية.

سلك التصحيح الضوء من LED ، والذي يتم التحكم فيه بواسطة برنامج تشغيل LED أحادي القناة. بعد ذلك ، قم بإزالة لاصق السيليكون فوق حج القحف. ضع محلول ملحي دافئ على سطح الدماغ بشكل دوري لمنع سطح الدماغ من الجفاف أثناء جلسة التسجيل.

إذا لزم الأمر ، قم بإزالة الجافية بملاقط حادة. هنا ، تم تسجيل استجابات السنبلة في القولون السفلي للفئران المستيقظة قناة VGATRHODOPSIN-II. في القولون السفلي لقناة VGATRHODOPSIN-II الفئران ، تعبر الخلايا العصبية GABAergic على وجه التحديد عن channelrhodopsin-II.

في الفئران المستيقظة ، تم إثارة الخلايا العصبية GABAergic و glutamatergic أو قمعها على التوالي عندما تم إعطاؤها محفزات خفيفة. عندما يتم توصيل الحافز الضوئي من خلال القطب الزجاجي ، فإنه يثير استجابات سبايك في بعض الخلايا العصبية. في المقابل ، في الخلايا العصبية الأخرى ، قمعت المحفزات الضوئية استجابات الارتفاع المستحدثة بواسطة المحفزات الصوتية.

تظهر هذه النتائج أن المرجعية الزجاجية يمكنها تسجيل نشاط الوحدة المفردة المعزولة جيدا وتحفيز الخلايا العصبية المسجلة بشكل موثوق عن طريق الضوء. بعد التطوير ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف كيفية عمل أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في التجويف العصبي لمناطق الدماغ المختلفة.