غشاء يعيد البناء من حويصلات العملاقة في استجابة للتدرجات أيون الكالسيوم مترجمة

نقدم تقنية للتلاعب بالحويصلات العملاقة باستخدام تدرجات أيونات الكالسيوم الموضعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التحفيز غير التلامس تماما لسطح الحويصلة والتصور المباشر لإعادة تشكيل الغشاء الدهني عند التفاعل مع أيونات الكالسيوم. يقدم نهجنا وسيلة لمعالجة تفاصيل تفاعلات غشاء أيون الكالسيوم ، مما يوفر أماكن جديدة لدراسة آليات إعادة تشكيل غشاء الخلية عند التغيرات في البيئة الدقيقة للخلية.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد محلول من الدهون في الكلوروفورم. التركيز النهائي للدهون في الكلوروفورم هو ملليغرام واحد لكل مليلتر ، والكتلة النهائية 0.6 ملليغرام. لف القارورة الزجاجية التي تحتوي على خليط الدهون بورق معدني لحماية المحتويات من الضوء المحيط.

ضع قارورة العينة الملفوفة بورق معدني داخل دورق زجاجي. لإزالة الكلوروفورم ، قم بتبخير المذيب في مبخر دوار لمدة ثلاث ساعات مع وصول الضغط إلى سبعة كيلو باسكال فراغ عند 80 دورة في الدقيقة. يتم تشكيل طبقة دهنية جافة في قاع القارورة الزجاجية بعد التبخر.

أضف ببطء 600 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات فوق طبقة الدهون المجففة. بعد إضافة المخزن المؤقت ، أضف برفق ستة ميكرولترات من الجلسرين لحماية العينة من الجفاف الكامل أثناء تكوين حويصلة عملاقة أحادية الصفيحة متصلة بحويصلة متعددة الصفائح ، أو GUV-MLV. أغلق القارورة الزجاجية باستخدام Parafilm.

وتغطيتها بورق معدني للحماية من الضوء المحيط. قم بتخزين القارورة على حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، صوتنة القارورة الزجاجية التي تحتوي على المحلول لمدة دقيقة واحدة باستخدام حمام الموجات فوق الصوتية في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة البارافيلم والماصة حتى يتم تشكيل محلول موحد بصريا من الحويصلات الدهنية الصغيرة. Aliquot 30 ميكرولترا من محلول الحويصلة الدهنية الصغيرة التي تم الحصول عليها في أنابيب بلاستيكية فردية 0.5 مل. قم بإذابة أنبوب بلاستيكي يحتوي على جزء من المعلق المجمد للحويصلات الدهنية الصغيرة في درجة حرارة الغرفة.

بتدوير الأنبوب أربع مرات لمدة ثانية إلى ثانيتين باستخدام خلاط دوامة بأقصى سرعة. ضع خمسة ميكرولترات من تعليق الحويصلة الدهنية الصغيرة على سطح زلة الغطاء الزجاجي لتشكيل قطرة صغيرة مستديرة. استخدم غطاء زجاجي بدون أي خطوات تنظيف مسبق.

الآن ، ضع الغطاء الزجاجي في مجفف فراغ لمدة 20 دقيقة. قم بتخزين طبقة الدهون المجففة في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. بعد ذلك ، قم ببسط 50 ميكرولتر من 10 مللي مولار HEPES فوق طبقة الدهون الجافة لإعادة الجفاف.

انتظر خمس دقائق لتشكيل مجمعات GUV-MLV. ضع غطاء زجاجيا في توسيط على مسرح المجهر. بعد ذلك، قم بوضع 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت HEPES عليها وضع مركز القطرة فوق الهدف.

انقل 50 ميكرولترا من محلول GUV-MLV المشكل مسبقا إلى محلول HEPES. انتظر 25 دقيقة للسماح لمجمعات GUV-MLV قليلة التكوين بالالتصاق بقوة بسطح الغطاء الزجاجي. قم بتدوير حواف الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات عن طريق وضع الأطراف الشعرية برفق في لهب الشمعة لمنع كسر الماصة الدقيقة أثناء توصيلها بحامل الماصة الدقيقة.

اسحب ما لا يقل عن ثلاثة شعيرات دموية زجاجية باستخدام مجتذب ليزر أوتوماتيكي. استخدم الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات المشار إليها في النص للحصول على ماصة دقيقة بفتحة طرف يبلغ قطرها حوالي 0.3 ميكرون. لتجنب انسداد طرف الماصة، قم بتصفية محلول كلوريد الكالسيوم المكون من خمسة مللي مولار في محلول عازلة HEPES باستخدام مرشح حقنة من 0.2 إلى 0.5 ميكرون قبل الاستخدام.

بعد ذلك، قم بإعادة ملء كل ماصة دقيقة بثمانية ميكرولترات من محلول كلوريد الكالسيوم باستخدام محمل دقيق. قم بتوصيل حامل ماصة دقيقة بمعالج دقيق. قم بتركيب الماصة الدقيقة في حامل الماصة الدقيقة بإحكام.

ثم قم بتوصيل مضخة الحقن وحامل الشعيرات الدموية باستخدام أنبوب الإمداد. بعد بدء تشغيل مضخة الحقن ، اضبط الإعدادات على مضخة الحقن على ضغط حقن 20 سداسي. اضبط أيضا ضغط تعويض خمسة سداسي.

اضبط المجهر على وضع المجال الساطع. قم بتكوينه لتباين التداخل التفاضلي. استخدم الملاعب الدقيقة الخشنة لوضع الماصة الدقيقة فوق القطرة التي تحتوي على مجمعات GUV-MLV.

حدد موقع طرف الماصة الدقيقة فوق الهدف وقم بإسقاط الماصة إلى القطرة باستخدام المعالج الدقيق الخشن. اضبط المجهر على وضع التألق. ضع طرف الماصة الدقيقة على مسافة ثلاثة ميكرون من سطح الغشاء أثناء حقن محلول كلوريد الكالسيوم من الماصة الدقيقة للسماح بتكوين MTPs.

لترجمة MTPS على طول سطح GUV، حرك طرف الماصة ببطء حول سطح GUV باستخدام المعالج الدقيق الدقيق. حافظ على نفس المسافة تقريبا بين سطح GUV وطرف الماصة الدقيقة مع الاستمرار في حقن أيونات الكالسيوم. لإيقاف الحقن المجهري ، قم بإيقاف تشغيل مضخة الحقن.

هنا صورة مجهرية فلورية تمثيلية لمركب GUV-MLV الثابت على سطح غطاء زجاجي. يمكن رؤية النتوءات الأنبوبية الغشائية المتولدة عند الحقن الموضعي لأيونات الكالسيوم على سطح GUV في هذه الصور. تؤدي ترجمة طرف الماصة الدقيقة حول سطح الغشاء كما هو موضح في السهم إلى تحريك حركة النتوءات الأنبوبية الغشائية في اتجاه مصدر أيون الكالسيوم.

للتلخيص ، نقترح تقنية تسمح بإعادة تشكيل الغشاء بدون تلامس للحويصلات الدهنية العملاقة مما أدى إلى تكوين نتوءات أنبوبية غشائية عند التحفيز الموضعي بأيونات الكالسيوم. تشمل التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة الانتقال من حويصلات الدهون الاصطناعية إلى الأغشية البيولوجية الأصلية أو تطبيق هذا النهج على الأنظمة البوليمرية بغرض تطوير منصات معالجة دقيقة بدون تلامس.