Name: زراعة أنسجة المبيض تصور الظواهر في المبيض الماوس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: تعلم زراعة أنسجة المبيض لدراسة تطور الجريبات والإباضة في الفئران. تتيح هذه الطريقة مراقبة الظواهر المبيضية في الوقت الفعلي تحت ظروف مضبوطة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن نشكر الدكتور مينامي ناوجيرو (جامعة كيوتو) لتوفير الفئران Oog1pro3.9 . أيد هذا البحث JSPS (كاكينهي # JP15H06275) ومؤسسة نيتو.

تم إيواء الفئران في غرفة التحكم بيئياً في 23 ± 1 درجة مئوية مع ح 12 ضوء/12 ح دورة الظلام. بروتوكولات الرعاية الحيوانية وتجارب أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية "التجارب الحيوانية" في جامعة الطب إيشي ووافقت عليها واجب رعاية الحيوانات واستخدام اللجنة.
1-إعداد الثقافة المتوسطة وأطباق
<ol><li>إعداد الأساسية الثقافة المتوسطة، إضافة المصل الجنيني البقري (FBS، 5% v/v)، FSH (100 mIU/mL)، LH (10 mU/mL)، والبنسلين-ستربتوميسين (البنسلين، يو/مليلتر 100؛ ستربتوميسين، 100 مغ/مل) إلى الحد الأدنى الأساسية المتوسطة ألفا (MEM-ألفا) ومزيج في أنابيب 50 مل. ملاحظة: مجموع أحجام الوسائط الثقافة المطلوبة تختلف بين التجارب، ولكن 1 مل من الثقافة المتوسطة يكفي بوجه عام عن 3.5 سم أسفل الزجاج ثقافة الأطباق.</li>
	<li>صب مختبرين 1 مل من مختلطة الثقافة المتوسطة في 3.5 سم أسفل الزجاج ثقافة الأطباق وتعيين مكان مم 30 خلية إدراج الثقافة في الأطباق. وسائل الإعلام قبل الحارة والاطباق في حاضنة (5% CO2 و 37 درجة مئوية).</li>
</ol>2-إعداد أنسجة المبيض
<ol><li>فوسفات الحارة قبل مخزنة المالحة (PBS) (−) والفنزويلية-ألفا التي تحتوي على 5% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 مغ/مل في حاضنة (5% CO2 و 37 درجة مئوية). ملاحظة: حوالي 3 مل مختبرين "برنامج تلفزيوني" (−) كل المبيض تكفي للاستخدام أثناء تشريح المبيض، ومختبرين 1 مل من MEM-ألفا كافية لتخزين عابر المبايض واحد في الأطباق 3.5 سم.</li>
	<li>
المكوس المبايض من الفئران الممثل المدني الدولي (المسماة بعد معهد أبحاث السرطان) الإناث 4-الأسبوع القديمة وقطع الأنسجة المحيطة بالمبيض باستخدام مقص وملاقط تحت مجهر مجسمة. احتياطي المبيض تمت إزالتها في الثقافة المتوسطة (راجع الخطوة 2، 1) حتى الاستخدام.
	<ol>
<li>قبل استعد مكان المبايض واحدة على ورقة تصفية مبلل مع "برنامج تلفزيوني" (−) (راجع الخطوة 2، 1) وشريحة إلى 4 قطع باستخدام شفرة مبضع تحت مجهر مجسمة. ملاحظة: المبايض فئران الممثل المدني الدولي 4-الأسبوع القديمة حوالي 2 ملم في القطر. عدد القطع يعتمد على حجم المبيض؛ بيد أن حوالي 500 ميكرومتر سميكة قطعة تسمح للملاحظات جريب السليم (في قطع أكثر سمكا من 500 مم، انخفض الأنسجة الشفافية؛ وكسر المسام antral العديد من القطع أرق من 500 ملليمتر، وفقدت).</li>
		<li>بعد التشريح، وضع العينات المبيض شرائح في مستنبت المعالجون مسبقاً في الأطباق 3.5 سم (راجع الخطوة 2، 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. زراعة أنسجة المبيض
<ol><li>إسقاط حوالي 0.5 ميليلتر من المتوسطة الثقافة الواحدة وشرائح أنسجة المبيض على إدراج الثقافة الخلية حيث سيتم أنسجة المبيض تعيين باستخدام ميكروبيبيتي.</li>
	<li>ضع كل شرائح العينة إلى انخفاض المتوسط الثقافة على إدراج الثقافة الخلية باستخدام الملقط.</li>
	<li>الثقافة أنسجة المبيض في 5% CO2 في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>استبدال المتوسطة الثقافة مع متوسط حرارة قبل جديدة كل يومين. ملاحظة: الجدول الزمني للتغييرات متوسطة لثقافة المقاطع المبيض من الفئران الممثل المدني الدولي 4-الأسبوع القديم يرد في الشكل 1.<ol>
<li>إنتاج طفرة LH, علاج مثقف المبايض الفئران الممثل المدني الدولي 4-الأسبوع القديمة مع المتوسط التي تحتوي على 100 مو/مل FSH و LH ح 12 كل 4 أيام (الشكل 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-المجهر الصور لاستزراع المبيض
<ol><li>بدء التصوير المبايض مثقف بعد يوم 1 عندما انضمت الأنسجة على إدراج الثقافة في الخلية، وإجراء تحليلات مجهر [كنفوكل] أو مقلوب في فترات ح 24 للسماح بنمو جريب كافية بين النقاط الزمنية. ملاحظة: الفحص المجهري [كنفوكل] متفوقة على المجهر المقلوب لمراقبة المسام في المبيض كله مثقف.</li>
</ol>5-الوقت الفاصل بين التصوير لاستزراع المبيض
<ol><li>
تحسين ظروف الوقت الفاصل بين التصوير، بما في ذلك كثافة الليزر وأوقات التعرض لنظام التصوير (الجدول 1).
	<ol>
<li>تحديد العينات المزدوجة المبيض من الفئران واحدة للاستخدام كمجموعات العلاج والتحكم. وتختلف كثافة الليزر ووقت التعرض تحقيق أفضل الصور (الجدول 1).</li>
		<li>مقارنة نمو جريب تحت كل شرط الثقافة عن طريق قياس المجالات جريب في صور عينات التحكم في فترات ح 24 وفي الوقت الفاصل بين العينات التصوير (راجع الخطوة 6). وفي الوقت نفسه، عد من بويضات أوفولاتيد في كل مجموعة المبيض واختيار أفضل الظروف الوقت الفاصل بين التصوير.</li>
	</ol>
</li>
	<li>التقاط الصور في فواصل 30 دقيقة باستخدام الوقت الفاصل بين نظام التصوير ظروف محددة (الجدول 1).</li>
</ol>6-تحليل النمو جريب
<ol><li>
لتحليل وضع جريب، قياس مجالات جريب في الصور التي تم التقاطها باستخدام برنامج إيماجيج (http://resbweb.nih.gov/ij/).
	<ol>
<li>في البداية، بتعيين حجم الصورة بواسطة النقر فوق "ضبط مقياس" تحت "تحليل" في شريط الأدوات. أدخل طول الجانب من الصورة التي تم التقاطها والأرقام المقابلة بكسل في الحقول الفارغة من "المسافة المعروفة باسم" و "المسافة بالبكسل"، على التوالي.</li>
		<li>انقر فوق "اليد الحرة" في شريط الأدوات، ومخطط المسام في الصور الميدانية مشرق الملتقطة.</li>
		<li>انقر فوق "إجراء" إطار "تحليل" في شريط الأدوات. ملاحظة: إذا هي رغبت في بيانات القياس الأخرى، انقر فوق "تعيين القياس" تحت "تحليل" في شريط الأدوات، والتحقق من المربعات المناسبة في القائمة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7-تحليل التنمية المسام باستخدام الفئران المعدلة وراثيا
<ol><li>جمع المبايض من شريحة يوما بعد الولادة 0 و 4 (P0 و P4) أنثى الفئران المعدلة وراثيا التي تتضمن في المتسلسلات Oog1pro3.9 و R26-H2B-مشير، والثقافة على إدراج كما هو موضح في الخطوات 1.1 – 3.2، إلا إذا لم تقم بذلك P0 والمبايض P4.</li>
	<li>استبدال المتوسطة الثقافة المتوسطة الطازجة، والمعالجون مسبقاً في الأطباق 3.5 سم في حاضنة الذي يحتوي على 5% CO2 في 37 درجة مئوية كل يومين. ملاحظة: تركيز LH في الأجلين المتوسط وثقافة من المبايض P0 و P4 يمكن أن تظل ثابتة لأن لا تحدث العواصف LH في الفئران P0 و P4.</li>
	<li>تعيين المجهر لتصور فقط إيجابية AcGFP1 المسام الأولية في المبيضين P4 المستزرعة (الجدول 1). ملاحظة: المسام الأساسي والابتدائي فقط موجودة في المبيضين الماوس الإناث P4.</li>
	<li>التقاط الصور من مثقف P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-مشري المبايض الفئران المحورة وراثيا على فترات 30 دقيقة باستخدام الإعدادات المستخدمة المبايض P4 (راجع الخطوة 5، 2).</li>
	<li>تتبع وتحليل التنمية المسام باستخدام الإشارات AcGFP1 ومشري H2B.</li>
</ol>

<ol><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li>
<li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li>
<li>Palma, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biotechnology+of+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+World+J%22%5BJournal%5D)">Biology and biotechnology of follicle development.</a> Sci World J. , (2012).</li>
<li>Knight, P. G., Glister, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16885529">TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development.</a> Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).</li>
<li>Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19074213">The in vitro growth and maturation of follicles.</a> Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).</li>
<li>Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li>
<li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li>
<li>Komatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Effect+of+Leukemia+Inhibitory+Factor+on+Follicular+Growth+in+Cultured+Murine+Ovarian+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue.</a> Biol Reprod. 93 (1), 18(2015).</li>
<li>Komatsu, K., Masubuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration-dependent+effect+of+progesterone+on+follicle+growth+in+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary.</a> J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).</li>
<li>Murase, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+dynamics%3A+visualization+and+analysis+of+follicle+growth+and+maturation+using+murine+ovarian+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture.</a> J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).</li>
<li>Ishida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+the+oocyte-specific+gene%2C+Oog1%2C+functions+in+both+male+and+female+meiotic+germ+cells+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice.</a> PLoS One. 8 (7), 68686(2013).</li>
<li>Minami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesin+is+a+novel+mouse+protein+expressed+in+oocytes+and+early+cleavage-stage+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos.</a> Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+factor-9+stimulates+progression+of+early+primary+but+not+primordial+rat+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development.</a> Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).</li>
<li>Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+inhibitory+factor+%28LIF%29+promotes+the+primordial+to+primary+follicle+transition+in+rat+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries.</a> Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-4+acts+as+an+ovarian+follicle+survival+factor+and+promotes+primordial+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development.</a> Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit+ligand+and+basic+fibroblast+growth+factor+interactions+in+the+induction+of+ovarian+primordial+to+primary+follicle+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition.</a> Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditional+reporter+mouse+lines+at+ROSA26+locus+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li>
<li>Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+oocyte-specific+expression+of+Cre+recombinase+activity+in+GDF-9-iCre%2C+Zp3cre%2C+and+Msx2Cre+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice.</a> Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).</li>
<li>Payer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stella-GFP+transgenic+mice%3A+a+novel+tool+to+study+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development.</a> Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).</li>
<li>Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive%2C+non-invasive+visualization+of+primordial+germ+cell+development+in+mice+by+the+Prdm1-mVenus+and+Dppa3-ECFP+double+transgenic+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter.</a> Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

في هذه الدراسة، قمنا بتطوير أسلوبي جديد لدراسة التنمية جريب في المبيضين الماوس. الأسلوب الأول ينطوي على ثقافة الفئران الكبار المبيض شرائح الأنسجة متبوعاً بتحليلات للتنمية جريب، والثاني ينطوي على استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لتصور التنمية جريب المبكرة مرحلة مستقلة تروج. سابقا، استخدام أسلوب زراعة أنسجة المبيض الحالي لتقييم أثر العوامل المثبطة اللوكيميا والبروجسترون على جريب التنمية8،9، وتبين أن آثارها تختلف مع مرحلة التركيز والمسام. في هذه الدراسة، شرائح أنسجة...

الماوس الإناث المبايض تحتوي على عدة آلاف من المسام1، ونضوج التبويض الدورية حوالي عشر بويضات في كل دورة السفاد. المسام وتصنف إلى عدة مراحل النمو: البدائي، والابتدائي والثانوي، أنترال، وجراب جرافيان، اعتماداً على شكل طبقة الخلايا granulosa المحيطة بكل البويضات. معظم المسام البدائية نائمة، وبعضهم يتم تفعيلها وتنمو لتصبح المسام الأولية في كل دورة السفاد2. بعد المرحلة الثانوية جرابي، تنظمه التنمية جريب أساسا gonadotropins، جرابي تحفيز هرمون (FSH) والهرمون (LH). بيد أن التنمية جريب البدائية والأولية بشكل مستقل تروج والآليات التنظيمية التي تحكم هذه المراحل تظل سيئة إينديرستود3،،من45. بالإضافة إلى عوامل النمو والهرمونات، ينظم التفاعلات بين المسام6،7المسام البدائية والأولية. ولذلك، بإجراء تحليلات لديناميات جريب في أنسجة المبيض الماوس، والتحقيق في الآليات التنظيمية المرتبطة باستخدام زرع الأنسجة المبيض8،،من910.
هنا، نحن نقدم طريقتين نموذج زراعة أنسجة المبيض. الأولى تستخدم لتحليل التنمية جريب بقياس مناطق جرابي، ويستخدم الثاني لدراسة الآلية التنظيمية أثناء المبكرة جريب من البدائية إلى المرحلة الثانوية المسام مع الفئران المعدلة وراثيا. لتحليل التنمية جريب، استخدمنا أساسا المبايض فئران الإناث 4-الأسبوع القديمة لأنها تسمح للتصور سهلة للمسام. للحث على الإباضة الدورية ونموذج التنمية في فيفو جريب، نحن استنسخت طفرة LH والاباضه الملاحظة، والكبدية المسام وإفراز الاستراديول تحت ظروف زراعة الأنسجة. تم القبض على الصور لاستزراع المبيض، وتم تحليل عمليات التنمية جريب بتتبع التغييرات في منطقة جرابي. ومع ذلك، في الحقل مشرق تحليلات مجهرية، التمييز بين المسام الأولية البدائية وأوائل الواضح. وبالتالي، قمنا بتطوير أسلوب للكشف عن المسام الصغيرة، والتمييز بين البدائي، الابتدائي، ومثقف جريب الثانوية في أنسجة المبيض باستخدام Oogenesin1 pro3 (Oog1)- 9 والمبايض R26-H2B-مشري الفئران المعدلة وراثيا في الأيام 0 و 4 بعد الولادة11. التعبير Oog1 قابلاً للاكتشاف في بويضات بعد الدخول إلى الانقسام، ويزيد تدريجيا مع التنمية المسام، مما يتيح رصد الانتقال من البدائي للمسام الأولية باستخدام الصور الوقت الفاصل بين أنسجة المبيض مثقف11 ،12. على الرغم من أن قد استخدمت الطرق المورفولوجية لدراسة العوامل التي تنشيط المسام البدائية نائمة13،14،،من1516، التنمية جريب الفسيولوجية في المبيضين صعوبة في مراقبة، ولا تزال آثار العوامل المختلفة أونتشاراكتيريزيد. وصممت أساليب الثقافة الحالية لمعالجة هذه الندرة في الوقت الحقيقي تحليلات عوامل الهدف.
في هذه الدراسة، ونحن تتبع التنمية الحبيبي باستخدام طريقة تصوير الوقت الفاصل بين وتتميز عملية التنمية جريب. لدينا أساليب مبتكرة توفر أداة غير مسبوقة للتحقيق فسيولوجيا المبايض.

<table><tbody><tr><td>هرمون تحفيز الجريب من الغدة النخامية البشرية</td><td>SIGMA</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>هرمون التشحيم من الغدة النخامية للخيول</td><td>SIGMA</td><td>L9773</td><td></td></tr><tr><td>محلول البنسلين والستربتومايسين</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>MEM a ، GlutaMax ، بدون نيوكليوتيدات</td><td>Thermo Fisher</td><td>32561037</td><td></td></tr><tr><td>طبق القاع الزجاجي</td><td>MatTek</td><td>طبق P35G-0-10-C</td><td>35 مم ، غطاء رقم 0 ، قطر زجاجي 10 مم</td></tr><tr><td>إدراج ثقافة خلية</td><td>Millicell PICM0RG50 ميرك ميليبور</td><td></td><td>القطر: 315 مم ، حجم المسام: 0.4 مم ، المواد: أطباق زراعة الخلايا المحبة للماء PTTE</td></tr><tr><td>3.5 سم</td><td>Greiner bio-one</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>50 مل / أنبوب الطرد المركزي مع غطاء ختم ثلاثي</td><td>IWAKI</td><td>2345-050</td><td></td></tr><tr><td>شفرات منخفضة المستوى يمكن التخلص منها 819</td><td>Leica</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>مجهر متحد البؤر</td></tr><tr><td>CellVoyager ، CV1000</td><td>Yokogawa Electric Corporation</td><td></td><td>تصوير الفاصل الزمني</td></tr><tr><td>BZ-X700</td><td>KEYENCE</td><td></td> تصوير <td>اللقطات المتتابعة</td></tr></tbody></table>

زراعة أنسجة المبيض تصور الظواهر في المبيض الماوس

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

أوفولاتي الإناث الثدييات دورياً على عدد يكاد يكون مستمرا من بويضات خلال كل دورة السفاد. للحفاظ على مثل هذا الانتظام وتواترها، يحدث التنظيم على مستوى محور طائي جوندال الغدة النخامية وعلى تطوير المسام في المبيض. على الرغم من الدراسات النشطة، آليات التنمية المسام ليست واضحة عدة الخطوات التي تنطوي عليها من تنشيط المسام البدائية نائمة للتبويض، وبسبب تعقيد التنظيم التي تختلف في كل مرحلة من مراحل الحبيبي. للتحقيق في آليات التنمية جريب، وديناميات المسام طوال دورة السفاد، قمنا بتطوير نموذج زراعة أنسجة المبيض ماوس التي يمكن استخدامها لمراقبة التنمية المسام باستخدام مجهر. التنمية جريب منتظمة والاباضه دورية الكبدية جريب يمكن جميع تكون مستنسخة في نموذج مثقف المبيض، ويمكن أن تكون شروط الثقافة والتضمين تجريبيا. هنا، علينا أن نبدي بفائدة هذا الأسلوب في دراسة آليات تنظيمية للتنمية المسام وغيرها من الظواهر المبيض.

ويبين الشكل 1 البروتوكول المتعلق بالتغييرات في وسائل الإعلام أثناء زراعة أنسجة المبيض. وبعد هذا البرنامج، عمرها 4 الأسبوع الممثل المدني الدولي الفئران المبايض مثقف وتصويرها على فترات 24-ح استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] (الشكل 2). خلال ثقافة أنسجة المبيض لمدة 3 أسابيع، كانت تحولت معظم المسام أنترال والثانوي قبل الكبدية المسام وبعضها أوفولاتيد (الشكل 2د و الجدول 2). في...

يمكن أن تستخدم كنماذج الكبدية التنمية والاباضه جريب جريب زرع الأنسجة المبيض وتشير إلى آليات تنظيمية للعمليات الدينامية المبيض.

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث المبيض حول تطور البصيلات ورتق البصيلات والتشغيل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا إعادة إنتاج ظواهر المبيض في ظل ظروف مزرعة خاضعة للرقابة للمراقبة في الوقت الفعلي. لتحضير المبايض من فأر معهد أبحاث السرطان البالغ من العمر أربعة أسابيع للثقافة: استخدم المقص والملاقط لتقليم الأنسجة المحيطة من المبايض تحت مجهر استريو ، ووضع المبايض التي تم تنظيفها في طبق من وسط الثقافة الطازجة.عندما يتم تقليم جميع المبايض ، انقل المبايض الفردية إلى قطعة من ورق الترشيح مبللة ب 37 درجة مئوية PBS ، واستخدم شفرة ميكروتوم لتقطيع كل مبيض إلى أربع قطع. انقل الشرائح إلى طبق 3.5 سم في وسط زراعة 37 درجة مئوية ، واستخدم ماصة دقيقة لإضافة قطرة حوالي 0.5 ميكرومتر من وسط المزرعة إلى إدراج ثقافة خلية واحد لكل قسم من أنسجة المبيض. في طبق ثقافة خلية ثان ذو قاع زجاجي يبلغ طوله 3.5 سم يحتوي على ملليمتر واحد من الوسط: باستخدام الملقط ، انقل عينة واحدة من الأنسجة إلى كل قطرة وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا.استبدل المادة الطافية في الطبق بوسط استزراع طازج 37 درجة مئوية كل يومين وعالج المبايض ب 100 مللي وحدة لكل ملليلتر من FSH و LH لمدة 12 ساعة كل أربعة أيام. البدء في تصوير المبايض المستنبتة كل 24 ساعة بعد يوم واحد من المزرعة للسماح بنمو البصيلات بشكل كاف بين جلسات التصوير. التقاط الصور على فترات 30 دقيقة باستخدام نظام تصوير بفاصل زمني في ظل الظروف التجريبية المناسبة. لتحليل تطور بصيلات المبيض: افتح الصور في ImageJ وافتح قائمة التحليل لتحديد مقياس التعيين.أدخل أطوال أضلاع الصور الملتقطة والأعداد المقابلة لوحدات البكسل في المسافة والمسافة المعروفتين في حقول البكسل، على التوالي. بعد ذلك ، استخدم أداة اليد الحرة لتحديد الخطوط العريضة للبصيلات والنقر فوق القياس. خلال فترة زراعة شرائح أنسجة المبيض التي تستغرق ثلاثة أسابيع ، تتدهور معظم البصيلات التاجية والثانوية بسبب رتق البصيلات ، وبعضها مبيض.تتطور بعض البصيلات في مجموعات خلال كل دورة زيادة في الهرمون اللوتيني (LH). في حين أن توقيت الإباضة وعدد البويضات المبيضة يختلف بين مبيض الفئران ، فإن الإباضة من المبايض المستنبتة تحدث في الغالب في غضون 48 ساعة من كل زيادة في الهرمون اللوتيني (LH). لاحظ أنه ليست كل البويضات المبوضة تطلق الأجسام القطبية الأولى بعد الإباضة.توجد البصيلات البدائية والأولية في وقت واحد في اليوم الرابع من مبيض الفئران. في حين أن البصيلات البدائية فقط موجودة في المبايض الصفرية بعد الولادة. ومع ذلك ، تصبح البصيلات الأولية قابلة للاكتشاف في المبايض الصفرية بعد الولادة بعد 30 إلى 40 ساعة من المزرعة كما هو موضح.يمكن أيضا تمييز البصيلات البدائية والأولية في المبايض المستنبتة المعزولة من المعدلة وراثيا mCherry بواسطة النوى الإيجابية للخلايا الحبيبية. السماح بتتبع مراحل البصيلات في مزارع شرائح المبيض. آمل أن تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تكنولوجيا الإنجاب لاستكشاف تقنيات جديدة لعلاج الخصوبة.

ovarian-tissue-culture-to-visualize-phenomena-in-mouse-ovary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

ثقافة الخلايا الطبيعية في سياق ثلاثية الأبعاد من يمثل طريقة بديلة لدراسة الأحداث المبكرة اللازمة للتحول الخليوي وتكون الأورام. وتستخدم هذه الطريقة لزراعة المبيض الطبيعي والخلايا بوقي لدراسة الأحداث المبكرة في تكوين سرطان المبيض.

ألجينات الهلاميات المائية للثقافة الجهاز ثلاثي الأبعاد من المبيضين وناقلة البيضات

يصف هذا البروتوكول الثقافة الابتدائية / ثقافة مشتركة من الماوس أنسجة المبيض، وذلك باستخدام المبايض من الفئران حديثي الولادة وحويصلات المبيض الفردية من الفئران سابق للبلوغ. تقنيات ثقافة تدعم التنمية بطريقة الفسيولوجية للغاية، مما يسمح للتحقيق في تأثير العوامل الخارجية على المبيض، والتفاعلات بين الحويصلات المبيضية.

الثقافة والمشارك ثقافة ماوس المبايض وحويصلات المبيض

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحديد حجم المسام في المبيضين مثقف للفئران الصغار دون تقطيع المسلسل. استخدام الجهاز كاملة الفلورة والأنسجة المقاصة، تمزيقها المادية يتم استبداله بتقطيع الضوئية. هذا الأسلوب من إعداد العينة والتصور يحافظ على سلامة الجهاز ويسهل الآلي التقدير الكمي للخلايا المحددة.

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

في المختبر ثقافة قشرة المبيض البقري وتأثير الغذائية درج خطوة النظام الغذائي على البيئة الدقيقة المبيض هو تقديم. تم استزراع قطع قشرة المبيض لمدة سبعة أيام وتم تقييم المنشطات والسيتوكينات ومراحل الجريب. وكان العلاج النظام الغذائي درج الخطوة زيادة تولد الستيرويد مما أدى إلى تطور الجريب في الثقافة.

الأبقار المبيض القشرة الأنسجة الثقافة

هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا لتصوير المبايض بأكملها للتحليلات الكمية والنوعية باستخدام تلطيخ المناعة الكامل ، والمجهر متعدد الفوتونات ، والتصور والتحليل 3D. يستوعب هذا البروتوكول معالجة عالية الإنتاجية وموثوقة وقابلة للتكرار تنطبق على علم السموم والتشخيص السريري والمقايسات الجينومية لوظيفة المبيض.

التألق المناعي للمبيض الكامل ، والمقاصة ، والمجهر متعدد الفوتونات للتحليل الكمي 3D لاحتياطي المبيض النامي في الفأر

نحن نصف طرق عزل الخلايا الجسدية لمبيض الفئران عن جزء مليء بالستروما من المبيض، ولتوليد عضويات جسدية في مبيض الفأر باستخدام نهج خال من السقالات.

استكشاف البيئة الدقيقة للمبيض: طرق العزلة، والزراعة ثنائية الأبعاد، وزراعة الخلايا الجسدية لمبيض الفأر

نقدم هنا بروتوكولا يوفر أداة لفحص الآليات التنظيمية لجينات معينة أثناء تطور الحصين. يسمح استخدام التثقيب الكهربائي خارج الرحم وثقافة الشرائح العضوية بالتنظيم لأعلى ولأسفل للتعبير عن الجينات ذات الأهمية في الخلايا المفردة ومتابعة مصيرها أثناء التطور.

السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة

والهدف من هذا البروتوكول هو لوصف loss- وكسب من طريقة وظيفة التي تنطبق على تحديد neogenin بمثابة مستقبلات مرحلة معينة أن يؤدي إلى الأديم الظاهر الغاذي والخلايا الداخلية التمايز الشامل في الأجنة قبل الغرس الماوس.

Loss- ونهج كسب من وظيفة إلى التحقيق في خلية المبكر مصير محددات في سابق للانغراس أجنة الفئران

هذا العمل يدل على نهج جديد لتقييم الانتشار، والتمايز، وإمكانية تشكيل السفينة من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية (فيسس) من خلال الثديية زرع لوحة الدهون تليها كامل جبل إعداد الأنسجة للمراقبة المجهرية. كما يتم عرض استراتيجية تتبع النسب للتحقيق في سلوك فيسكس في الجسم الحي .

تقنية زرع الثدي الثديية الرواية جديدة لتصور الجيل سفينة من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية

هنا، نقدم بروتوكول للتصوير الحي من الماوس الانصهار الحنك الثانوي باستخدام المجهر متحد البؤر. هذا البروتوكول يمكن استخدامها في تركيبة مع مجموعة متنوعة من خطوط الماوس مراسل الفلورسنت، ومع مثبطات المسار لبصيرة الميكانيكية. ويمكن تكييف هذا البروتوكول للتصوير الحي في النظم التنموية الأخرى.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

تعلم زراعة أنسجة المبيض لدراسة تطور الجريبات والإباضة في الفئران. تتيح هذه الطريقة مراقبة الظواهر المبيضية في الوقت الفعلي تحت ظروف مضبوطة.

زراعة أنسجة المبيض تصور الظواهر في المبيض الماوس

استكشف المزيد من الفيديوهات