خالية كرة محددة وشروط الثقافة خالية من علبة التغذية بالورق "نماذج الخلية الشبكية" المستمدة من اللجنة التوجيهية جيل من البشر

إنتاج خلايا الشبكية المتخصصة من الخلايا الجذعية pluripotent نقطة تحول في تطوير العلاج القائم على الخلايا الجذعية لأمراض الشبكية. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة لجيل بكفاءة أورجانويدس الشبكية وظهاره المصطبغة الشبكية للبحوث الأساسية ومتعدية الجنسيات، والسريرية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال المتعلق بتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات في مجال الشبكية ، مثل توليد أنواع مختلفة من خلايا الشبكية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان أو خلايا iPS. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدام خلية iPS البشرية الملتصقة مباشرة لتوليد عضيات الشبكية عن طريق تمرير الجنين إلى التكوين فقط عن طريق التغيير المتتالي لوسط الاستزراع. ستعرض مهندسة المختبر أميلي سلمبروك بريك طريقة توليد وعزل عضيات الشبكية وستعرض مهندسة المختبر سيلين نانتو استراتيجية إنتاج الخلايا الظهارية المصطبغة في الشبكية أو الخلايا RPE.

ابدأ تمايز خلايا iPS بعد هذا التخطيطي, والتي يمكن العثور عليها في بروتوكول النص عندما تصل المستعمرات إلى 60 إلى 70٪ التقاء. تحضير أربعة ملليلتر من متوسط iPS القاعدي لكل طبق ستة سنتيمترات وتسخين الوسط إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتغيير وسيط خلية iPS إلى وسيط iPS الأساسي.

لاحظ هذه المرة على أنها اليوم صفر. في اليوم الثاني ، قم بتبديل الثقافات في وسط iPS القاعدي إلى وسط iPS N-2 القاعدي الذي تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية. قم بتغيير الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام.

تحديد عضيات الشبكية المكونة للخلايا الناشئة بواسطة براعم الظهارة العصبية. في اليوم 28 ، قم بإعداد ستة أطباق تحتوي على أربعة ملليلتر لكل بئر من وسط Pro B-27 ، مع استكمالها في البداية ب 10 نانوغرام لكل مليلتر من FGF2. استرجع هياكل الشبكية من الأطباق التي يبلغ طولها ستة سنتيمترات يدويا.

للقيام بذلك ، قم بعزل الهياكل عن طريق عمل خطوط عمودية بإبرة حول البرعم الظهاري العصبي وفصل العضيات عن طريق خدشها برفق بالإبرة. قم بشفط 10 إلى 15 عضوا باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر وانقلها في بئر واحد من الصفيحة المكونة من ستة آبار تحتوي على وسط Pro B-27. احتفظ بعضيات الشبكية في ظروف الاستزراع العائمة في وسط Pro B-27 في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

قم بتغيير نصف الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام. في اليوم 28 ، قم بتغيير الوسط إلى وسط Pro N-2 جديد تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية واستمر في تغيير وسيط Pro N-2 كل يومين إلى ثلاثة أيام. في اليوم 42 ، قم بإعداد صفيحة من 24 بئرا مطلية مسبقا بمصفوفة كما هو موضح في بروتوكول النص وتحتوي على مليلتر واحد من وسط Pro N-2 لكل بئر.

ضع الطبق لمدة 15 دقيقة في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل الاستخدام. استرجع تصحيحات iRPE البشرية يدويا من الطبق الذي يبلغ طوله ستة سنتيمترات. لعزل البقع ، قم بعمل خط عمودي بالإبرة حول الظهارة المصطبغة وافصل الورقة عن طريق خدشها برفق بالإبرة.

قم بشفط 10 بقع مصطبغة باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر ونقلها في بئر واحد من الصفيحة المكونة من 24 بئرا. احتفظ ببقع RPE البشرية المشتقة من iPS في وسط Pro N-2 في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة قبل تغيير الوسط. عندما تتلاقى الخلايا ، قم بإزالة الوسط باستخدام أنظمة الشفط الفراغي وغسل كل بئر مرة واحدة باستخدام مليلتر واحد من PBS باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر.

بعد التخلص من PBS باستخدام أنظمة الشفط الفراغية ، أضف 200 ميكرولتر لكل بئر بنسبة 0.25٪ تريبسين. احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 15 دقيقة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، ثم أضف 800 ميكرولتر من وسط Pro B-27 لتعطيل التربسين. الآن قم بفصل ورقة خلايا iRPE البشرية عن طريق ماصتها لأعلى ولأسفل.

ضع معلق الخلية في أنبوب سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 110 مرات جم ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في ملليلترين من وسط Pro N-2 الدافئ مسبقا عند 37 درجة مئوية ، ثم عد الخلايا بعداد الخلايا. الآن خذ 1.25 مليون خلية وضعها في قارورة T25 سنتيمتر مربع مغلفة بالمصفوفة تحتوي على خمسة ملليلتر من وسط Pro N-2 الذي تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.

بالنسبة للعضيات الشبكية الكاملة ، حدد خمسة إلى 20 عضوا من عضيات الشبكية باستخدام ماصة نقل وضعها في قارورة مبردة. قم بإزالة أي وسيط زائد باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر دون لمس العضيات الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب وأضف 250 ميكرولترا من وسط الحفظ بالتبريد البارد. قم بتجميد القوارير في وعاء تجميد قائم على الأيزوبروبرانول عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة أربع ساعات على الأقل.

بالنسبة لخلايا iRPE البشرية ، قم بفصل الخلايا عندما تلتقي عند الممر 1. قم بشفط الوسط من قارورة T25 سنتيمتر مربع باستخدام أنظمة الشفط بالتفريغ واغسله مرة واحدة بثلاثة ملليلتر من PBS باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر. بعد إزالة PBS ، أضف ملليلتر واحد من 0.25٪ من التربسين ، ثم احتضن الخلايا لمدة لا تقل عن 15 دقيقة في حاضنة عند 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، أضف خمسة ملليلتر من وسط Pro B-27 لإيقاف نشاط التربسين. افصل ورقة خلايا iRPE البشرية عن طريق ماصتها لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر. ضع معلق الخلية في أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بطرده لمدة خمس دقائق عند 110 مرات جم.

قم بشفط المادة الطافية باستخدام الشفط بالفراغ وأعد تعليق الخلايا برفق للحصول على مليوني خلية في 250 ميكرولتر من وسط الحفظ بالتبريد. انقل 250 ميكرولترا من تعليق الخلية لكل قارورة مبردة ، ثم قم بتجميد القوارير في حاوية تجميد قائمة على الأيزوبروبرانول عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة أربع ساعات على الأقل. من خزان النيتروجين السائل أو الفريزر 150 درجة مئوية تحت الصفر، قم بإذابة قارورة مبردة تحتوي على عضيات الشبكية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.

قم بتطهير القارورة المبردة بعناية باستخدام رذاذ محلول مطهر. افتح القارورة وأضف ملليلترا واحدا من وسط Pro B-27 المسخن مسبقا. الآن انقل العضيات إلى أنبوب 1.5 مليلتر باستخدام ماصة نقل.

قم بإزالة الوسط برفق عن طريق سحب العين دون لمس هياكل الشبكية في الجزء السفلي من الأنبوب. ثم اغسل العضيات مرة أخرى باستخدام مليلتر واحد من وسط Pro B-27 الدافئ مسبقا. قم بشفط العضيات بماصة نقل وضعها في بئر واحد من صفيحة مكونة من ستة آبار تحتوي على Pro B-27 متوسط التسخين المسبق ومتوازن في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لإذابة خلايا iRPE البشرية ، قم بتسخين وسط Pro N-2 عند 37 درجة مئوية. من خزان النيتروجين السائل أو الفريزر 150 درجة مئوية تحت الصفر، قم بإذابة عينة مبردة من خلايا iRPE Passage 1 البشرية عن طريق احتضانها في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. بعد تطهير القارورة المبردة كما كان من قبل ، افتح الأنبوب وأضف ملليلترا واحدا من وسط Pro N-2 الدافئ مسبقا ، ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على ملليلترين من وسط Pro N-2 الدافئ مسبقا.

بعد الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 110 مرات جم ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في ملليلترين من وسط Pro N-2 المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية. يمكن عزل الهياكل العصبية الشبكية المكونة للخلايا باستخدام إبرة ونقلها إلى ألواح الاستزراع للسماح بنضج عضيات الشبكية في ظروف الاستزراع العائمة. تحتوي هياكل الشبكية الناشئة بشكل أساسي على خلايا سلفية للشبكية ، والتي تؤدي إلى سبع فئات رئيسية من أنواع خلايا الشبكية ، كما يتصورها موجات من أجيال خلايا الشبكية المبكرة والمتأخرة أثناء عملية النضج في المختبر.

وبالتالي ، فإن وقت الثقافة يحدد أنواع الخلايا الموجودة في العضيات. اعتمادا على استنساخ خلية iPS البشرية ، يمكن اكتشاف البقع المصطبغة قبل أو بعد تكوين الخلايا لهياكل الشبكية ، بشكل عام بعد أسبوع أو أسبوعين من استخدام وسيط Pro N-2 في اليوم 28. يتم عرض صورة تمثيلية للحقل الساطع لخلايا iRPE البشرية الموسعة من البقع المعزولة في Passage 0.

تؤدي الثقافات طويلة الأمد إلى ظهارة ناضجة ووظيفية. تظهر هنا خلايا iRPE Passage 2 البشرية الناضجة في الأسبوع 52 ، والتي تتميز بمورفولوجيا حجرية مرصوفة بالحصى المكعبة الكلاسيكية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن كفاءة الطريقة الممثلة هنا تعتمد إلى حد كبير على جودة مزارع خلايا iPS البشرية.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إنشاء جميع أنواع خلايا الشبكية من أسلاف الشبكية الموجودة في العضوية في مرحلة مبكرة. إنها تشكل أدوات قوية لعلاج ونمذجة أمراض الشبكية المختلفة. يمكن استخدام خلية iPS الخاصة بالمريض لفهم مسببات الأمراض المعقدة أو الوراثية بشكل أفضل من خلال استكشاف الآلية الجزيئية والخلوية الكامنة وراء هذه الأمراض.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تطور الشبكية لاستكشاف الطب التجديدي لدى البشر. لا تنس أن العمل مع خلية iPS البشرية يتطلب احتياطات مهمة مثل حبس ثقافة الخلايا المحددة.