تنقية فعالة والتنمية LC MS/MS-المستندة إلى تحليل لأحد عشر-عشرة إزفاء-2 5-ميثيلسيتوسيني ديوكسيجيناسي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الوراثة اللاجينية وTET2 توسطت 5-Methylcytosine مجال إزالة الميثيل مثل هذا التحليل لنشاط الطفرات TET2 العادية والسريرية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن TET2 الأصلي يمكن تنقيته في خطوة واحدة، ويمكن تحليل نشاطها من حيث تشكيل جميع المنتجات الثلاثة. العديد من طلاب الدراسات العليا سوف تظهر هذا الإجراء.

سيتم إجراء تنقية البروتين من قبل تشايان بهاتاشاريا، مقايسة TET2 من قبل أنيندا سوندري داي، وتحليل LC-MS/MS من قبل نافيد أيون. للتحول البكتيري، إضافة ميكرولتر واحد من المؤتلف 14 متجه التعبير الوجهة التي تحتوي على tet2 ديوكسيجيناز الإنسان untagged إلى 100 ميكرولترات من الخلايا E.coli BL21 DE3 المختصة كيميائيا في أنبوب 1.7 ملليلتر. بعد حضانة على الجليد لمدة 15 دقيقة على الأقل، والحرارة صدمة الخليط في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية في حمام مائي.

مباشرة بعد الصدمة الحرارية، وضع الخلايا مرة أخرى على الجليد لمدة لا تقل عن دقيقتين. بعد ذلك، إضافة 250 ميكرولترات من مرق الأمثل السوبر مع القمع تقويض الخلايا. احتضان الخلايا البكتيرية لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في شاكر.

بعد الحضانة، تدور أسفل الخلايا عن طريق الطرد المركزي للأنبوب في 9، 000 مرة الجاذبية لمدة دقيقة واحدة. تجاهل 70٪ من عظمى عن طريق الأنابيب، وحل بيليه في وسائل الإعلام المتبقية. نشر تعليق الخلية على لوحة مرق ليروا أجار التي تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين.

احتضان لوحة لمدة 16 ساعة في 37 درجة مئوية. حدد مستعمرة واحدة معزولة، وتطعيمه في 10 ملليلتر من وسائط LB ampicillin. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية في شاكر بين عشية وضحاها.

بعد ذلك، استخدم 100 ميكرولترات من الثقافة البكتيرية لتطعيم 100 ملليلتر من وسائل الإعلام LB ampicillin كثقافة أولية. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية في شاكر بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تلقيح 15 قارورة، كل منها يحتوي على 600 ملليلتر من وسائل الإعلام LB أمبيسيلين مع ستة ملليلترات من الثقافة الأولية لكل قارورة.

احتضان القارورة في 37 درجة مئوية على شاكر في 180 دورة في الدقيقة. للتحقق من كثافة الثقافة البكتيرية، وقياس كثافتها البصرية في 600 نانومتر، أو OD600، باستخدام مقياس الطيف. بعد الثقافة تصل إلى كثافة 0.8 في OD600، والحث على التعبير عن بروتين TET2 مع 300 ميكرولترات من IPTG الضرس واحد في كل قارورة، وتنمو الثقافة لمدة 16 ساعة إضافية في 17 درجة مئوية.

بعد الحضانة، نقل الثقافة البكتيرية إلى زجاجات أجهزة الطرد المركزي. الطرد المركزي الثقافة البكتيرية التي تعبر عن إنزيم TET2 في 5، 250 مرة الجاذبية لمدة 45 دقيقة. استخدام بيليه البكتيرية لتنقية TET2.

العمل على الجليد أو في أربع درجات مئوية، وإعادة تعليق بيليه البكتيريا في 100 ملليلتر من 50 ملليمولار MES العازلة، ودرجة الحرارة السادسة. ثم تأخذ خمسة ملليلتر من تعليق الخلية، وتقديمه إلى 45 ملليلتر مع المخزن المؤقت. Sonicate تعليق لمدة خمس مرات 30 ثانية في السلطة 20، مع فترات التبريد 60 ثانية.

تدور في lysate في 5، 250 مرة الجاذبية لمدة 45 دقيقة. جمع supernatant التي تحتوي على إنزيم TET2 القابل للذوبان، وتمريره من خلال مرشحات 0.45 ميكرون قبل تحميلها على نظام FPLC. حزمة 30 ملليلتر من الراتنج تبادل الموجبة قوية في عمود FPLC.

اكويبير العمود مع 10 وحدات تخزين السرير من مخزن الغسيل بمعدل تدفق ثابت من 0.3 ملليلتر في الدقيقة الواحدة باستخدام نظام FPLC. تحميل lysate أوضح على العمود قبل التوازن، وغسل مع ما يقرب من 10 حجم السرير من مخزن الغسيل حتى يصبح تدفق من خلال واضحة. Elute TET2 باستخدام صفر إلى 10٪ التدرج من المخزن المؤقت لغسل إلى العازلة elution في 15 وحدة تخزين السرير، تليها عقد في 10٪ عازلة elution لكميات السرير اثنين.

جمع 100 عينات microliter من الخلية lysate قبل وبعد تحميل العمود ، جنبا إلى جنب مع جميع الكسور elution ، وتحليل على 10 ٪ حل SDS - صفحة هلام. تجمع الكسور التي تحتوي على بروتين TET2، وتجميد وتجفيف البروتين. ثم قم بحل الإنزيم في 10 ملليلتر من الماء، وتخزينها عند ناقص 80 درجة مئوية.

أداء جميع ردود الفعل demethylation في ثلاثية مع ثلاثة ميكروغرام من الركيزة. إضافة 100 ميكروغرام من تنقية إنزيم TET2 إلى 50 ميكرولترات من إجمالي التفاعل العازلة. بعد حضانة ساعة واحدة في 37 درجة، إخماد TET2 حفزت تفاعلات الأكسدة مع خمسة ميكرولترات من EDTA 500 ملليلتر.

لإعداد العينات للتحليل، قم بفصل الحمض النووي عن خليط التفاعل TET2 عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من عازلة الربط الأولي إلى 55 ميكرولترات من التفاعل المطفأ. بعد ذلك، إضافة 400 ميكرولترات من 100٪ الإيثانول إلى الخليط. تمرير هذا الخليط من خلال عمود الربط أوليغو.

بعد غسل الحمض النووي ملزمة مع 750 ميكرولترات من عازلة الغسيل، elute الحمض النووي في 20 ميكرولتر من الماء. الآن، هضم الحمض النووي المعزول مع وحدتين من DNase I و 60 وحدة من نواة S1 في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة لإنتاج أحادي الفوسفات أحادي الفوسفات النوي الفردية. بعد الهضم، إضافة وحدتين من العجل الفوشطة الفوسكاتي إلى العينات.

احتضان لمدة 12 ساعة إضافة في 37 درجة مئوية لإزالة مجموعات الفوسفات المحطة الطرفية من أحادي الفوسفات النووي، والحصول على النيوكليوسيدات. إعداد محلول مخزون ميكرومولار 100 من جميع النيوكليوسيدات السيتوسين المعدلة، وقواعد الحمض النووي العادية في المياه HPLC الصف لتطوير طريقة LC-MS / MS. تحسين المعلمات MS/MS المعتمدة على النوى عن طريق غرس حلول المخزونات كل مرة في مطياف الكتلة بمعدل تدفق 10 ميكرولترات في الدقيقة في وضع المسح MS المحسن.

يمكن تحسين العديد من المعلمات باستخدام ميزة التحسين الكمي الآلي للبرنامج لكل نوكليوسيد الحمض النووي. عند هذه النقطة، تحسين المعلمات المتبقية لكل نوكليوسيد الحمض النووي باستخدام ميزة التحسين الكمي اليدوي للبرنامج في وضع تحليل حقن التدفق. الآن، تحسين المعلمات MS/MS المعتمدة على المصدر عن طريق حقن 10 ميكرولترات من محلول الأسهم باستخدام تدرج مع 25٪ مذيب B بمعدل تدفق 0.3 ملليلتر في الدقيقة.

لفصل جميع النيوكليوسيدات النووية الثمانية للحمض النووي، قم بإجراء كروماتوغرافيا سائلة كما هو مفصل في بروتوكول النص على عمود C18. وأخيراً، كشف وتحديد جميع النيوكليوسيدات باستخدام طريقة LC-MS/MS في المنحنيات القياسية. وبما أن المجال الحفاز لـ TET2 له نقطة إيزوكهربتريك عالية نسبياً بالمقارنة مع معظم بروتينات الإشريكية القولونية الأصلية، فقد تم تطوير عملية تنقية فعالة باستخدام التصوير اللوني لتبادل الالات.

هذا التنقية أسفرت عن أكثر من 90٪ نقية TET2 انزيم في خطوة واحدة. من أجل فصل وتحديد المشتقات المختلفة ديوكسيسيتيدين وقواعد الحمض النووي الطبيعية الأربعة بعد رد فعل انزيمي TET2، تم تحسين مقايسة حساسة LC-MS/MS المستندة إلى. تم رسم المنحنيات القياسية باستخدام عمليات تخفيف متسلسلة لخليط يحتوي على جميع النيوكليوسيدات.

تظهر هنا نتائج أسلوب الكروماتوغرافيا السائلة MS/MS. تسمح هذه الطريقة بالفصل وتحديد كمي قواعد الحمض النووي الأربعة العادية ، وكذلك قواعد السيتوسين الأربعة المعدلة. في هذا الإجراء التجريبي، نحن وصف استنساخ غير الموسومة الإنسان TET2 dioxynase المجال الحفاز باستخدام تقنية إعادة التركيب موقع محدد وتعبير كاف في متجه الوجهة في كولاي.

نحن تنقية بكفاءة غير الموسومة TET2 انزيم استخدام تبادل اللوني الموجبة لتحقيق أكبر من 90٪ نقاء في خطوة واحدة. علاوة على ذلك، قمنا بتطوير طريقة كروماتوغرافية سائلة جديدة لفصل قواعد الحمض النووي الأربعة العادية وقواعد السيتوسين الأربعة المعدلة. لتحديد كمية النيوكليوسيدات الثمانية من التفاعلات المحفزة TET2 ، قمنا بالاقتران مع أسلوبنا اللوني السائل المحسن مع قياس الطيف الكتلي.

ثم تم استخدام المقايسة الحساسة LC-MS/MS لتحديد نشاط إنزيم TET2 البشري غير المُعَد. النهج الموصوف هنا سيعزز إلى حد كبير من تقييم نوع البرية و متحولة TET2 الديوكسيجيناز.