تنقية فعالة والتنمية LC MS/MS-المستندة إلى تحليل لأحد عشر-عشرة إزفاء-2 5-ميثيلسيتوسيني ديوكسيجيناسي
October 15th, 2018
هنا، فإننا نقدم بروتوكول لتنقية خطوة واحدة بكفاءة الإنسان معلم نشط إزفاء عشر-11-2 (TET2) ديوكسيجيناسي 5-ميثيلسيتوسيني باستخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني والتحليل استخدام كتلة سائل اللوني-جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-MS/MS)-النهج القائم.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الوراثة اللاجينية وTET2 توسطت 5-Methylcytosine مجال إزالة الميثيل مثل هذا التحليل لنشاط الطفرات TET2 العادية والسريرية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن TET2 الأصلي يمكن تنقيته في خطوة واحدة، ويمكن تحليل نشاطها من حيث تشكيل جميع المنتجات الثلاثة. العديد من طلاب الدراسات العليا سوف تظهر هذا الإجراء.
سيتم إجراء تنقية البروتين من قبل تشايان بهاتاشاريا، مقايسة TET2 من قبل أنيندا سوندري داي، وتحليل LC-MS/MS من قبل نافيد أيون. للتحول البكتيري، إضافة ميكرولتر واحد من المؤتلف 14 متجه التعبير الوجهة التي تحتوي على tet2 ديوكسيجيناز الإنسان untagged إلى 100 ميكرولترات من الخلايا E.coli BL21 DE3 المختصة كيميائيا في أنبوب 1.7 ملليلتر. بعد حضانة على الجليد لمدة 15 دقيقة على الأقل، والحرارة صدمة الخليط في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية في حمام مائي.
مباشرة بعد الصدمة الحرارية، وضع الخلايا مرة أخرى على الجليد لمدة لا تقل عن دقيقتين. بعد ذلك، إضافة 250 ميكرولترات من مرق الأمثل السوبر مع القمع تقويض الخلايا. احتضان الخلايا البكتيرية لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في شاكر.
بعد الحضانة، تدور أسفل الخلايا عن طريق الطرد المركزي للأنبوب في 9، 000 مرة الجاذبية لمدة دقيقة واحدة. تجاهل 70٪ من عظمى عن طريق الأنابيب، وحل بيليه في وسائل الإعلام المتبقية. نشر تعليق الخلية على لوحة مرق ليروا أجار التي تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين.
احتضان لوحة لمدة 16 ساعة في 37 درجة مئوية. حدد مستعمرة واحدة معزولة، وتطعيمه في 10 ملليلتر من وسائط LB ampicillin. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية في شاكر بين عشية وضحاها.
بعد ذلك، استخدم 100 ميكرولترات من الثقافة البكتيرية لتطعيم 100 ملليلتر من وسائل الإعلام LB ampicillin كثقافة أولية. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية في شاكر بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تلقيح 15 قارورة، كل منها يحتوي على 600 ملليلتر من وسائل الإعلام LB أمبيسيلين مع ستة ملليلترات من الثقافة الأولية لكل قارورة.
احتضان القارورة في 37 درجة مئوية على شاكر في 180 دورة في الدقيقة. للتحقق من كثافة الثقافة البكتيرية، وقياس كثافتها البصرية في 600 نانومتر، أو OD600، باستخدام مقياس الطيف. بعد الثقافة تصل إلى كثافة 0.8 في OD600، والحث على التعبير عن بروتين TET2 مع 300 ميكرولترات من IPTG الضرس واحد في كل قارورة، وتنمو الثقافة لمدة 16 ساعة إضافية في 17 درجة مئوية.
بعد الحضانة، نقل الثقافة البكتيرية إلى زجاجات أجهزة الطرد المركزي. الطرد المركزي الثقافة البكتيرية التي تعبر عن إنزيم TET2 في 5، 250 مرة الجاذبية لمدة 45 دقيقة. استخدام بيليه البكتيرية لتنقية TET2.
العمل على الجليد أو في أربع درجات مئوية، وإعادة تعليق بيليه البكتيريا في 100 ملليلتر من 50 ملليمولار MES العازلة، ودرجة الحرارة السادسة. ثم تأخذ خمسة ملليلتر من تعليق الخلية، وتقديمه إلى 45 ملليلتر مع المخزن المؤقت. Sonicate تعليق لمدة خمس مرات 30 ثانية في السلطة 20، مع فترات التبريد 60 ثانية.
تدور في lysate في 5، 250 مرة الجاذبية لمدة 45 دقيقة. جمع supernatant التي تحتوي على إنزيم TET2 القابل للذوبان، وتمريره من خلال مرشحات 0.45 ميكرون قبل تحميلها على نظام FPLC. حزمة 30 ملليلتر من الراتنج تبادل الموجبة قوية في عمود FPLC.
اكويبير العمود مع 10 وحدات تخزين السرير من مخزن الغسيل بمعدل تدفق ثابت من 0.3 ملليلتر في الدقيقة الواحدة باستخدام نظام FPLC. تحميل lysate أوضح على العمود قبل التوازن، وغسل مع ما يقرب من 10 حجم السرير من مخزن الغسيل حتى يصبح تدفق من خلال واضحة. Elute TET2 باستخدام صفر إلى 10٪ التدرج من المخزن المؤقت لغسل إلى العازلة elution في 15 وحدة تخزين السرير، تليها عقد في 10٪ عازلة elution لكميات السرير اثنين.
جمع 100 عينات microliter من الخلية lysate قبل وبعد تحميل العمود ، جنبا إلى جنب مع جميع الكسور elution ، وتحليل على 10 ٪ حل SDS - صفحة هلام. تجمع الكسور التي تحتوي على بروتين TET2، وتجميد وتجفيف البروتين. ثم قم بحل الإنزيم في 10 ملليلتر من الماء، وتخزينها عند ناقص 80 درجة مئوية.
أداء جميع ردود الفعل demethylation في ثلاثية مع ثلاثة ميكروغرام من الركيزة. إضافة 100 ميكروغرام من تنقية إنزيم TET2 إلى 50 ميكرولترات من إجمالي التفاعل العازلة. بعد حضانة ساعة واحدة في 37 درجة، إخماد TET2 حفزت تفاعلات الأكسدة مع خمسة ميكرولترات من EDTA 500 ملليلتر.
لإعداد العينات للتحليل، قم بفصل الحمض النووي عن خليط التفاعل TET2 عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من عازلة الربط الأولي إلى 55 ميكرولترات من التفاعل المطفأ. بعد ذلك، إضافة 400 ميكرولترات من 100٪ الإيثانول إلى الخليط. تمرير هذا الخليط من خلال عمود الربط أوليغو.
بعد غسل الحمض النووي ملزمة مع 750 ميكرولترات من عازلة الغسيل، elute الحمض النووي في 20 ميكرولتر من الماء. الآن، هضم الحمض النووي المعزول مع وحدتين من DNase I و 60 وحدة من نواة S1 في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة لإنتاج أحادي الفوسفات أحادي الفوسفات النوي الفردية. بعد الهضم، إضافة وحدتين من العجل الفوشطة الفوسكاتي إلى العينات.
احتضان لمدة 12 ساعة إضافة في 37 درجة مئوية لإزالة مجموعات الفوسفات المحطة الطرفية من أحادي الفوسفات النووي، والحصول على النيوكليوسيدات. إعداد محلول مخزون ميكرومولار 100 من جميع النيوكليوسيدات السيتوسين المعدلة، وقواعد الحمض النووي العادية في المياه HPLC الصف لتطوير طريقة LC-MS / MS. تحسين المعلمات MS/MS المعتمدة على النوى عن طريق غرس حلول المخزونات كل مرة في مطياف الكتلة بمعدل تدفق 10 ميكرولترات في الدقيقة في وضع المسح MS المحسن.
يمكن تحسين العديد من المعلمات باستخدام ميزة التحسين الكمي الآلي للبرنامج لكل نوكليوسيد الحمض النووي. عند هذه النقطة، تحسين المعلمات المتبقية لكل نوكليوسيد الحمض النووي باستخدام ميزة التحسين الكمي اليدوي للبرنامج في وضع تحليل حقن التدفق. الآن، تحسين المعلمات MS/MS المعتمدة على المصدر عن طريق حقن 10 ميكرولترات من محلول الأسهم باستخدام تدرج مع 25٪ مذيب B بمعدل تدفق 0.3 ملليلتر في الدقيقة.
لفصل جميع النيوكليوسيدات النووية الثمانية للحمض النووي، قم بإجراء كروماتوغرافيا سائلة كما هو مفصل في بروتوكول النص على عمود C18. وأخيراً، كشف وتحديد جميع النيوكليوسيدات باستخدام طريقة LC-MS/MS في المنحنيات القياسية. وبما أن المجال الحفاز لـ TET2 له نقطة إيزوكهربتريك عالية نسبياً بالمقارنة مع معظم بروتينات الإشريكية القولونية الأصلية، فقد تم تطوير عملية تنقية فعالة باستخدام التصوير اللوني لتبادل الالات.
هذا التنقية أسفرت عن أكثر من 90٪ نقية TET2 انزيم في خطوة واحدة. من أجل فصل وتحديد المشتقات المختلفة ديوكسيسيتيدين وقواعد الحمض النووي الطبيعية الأربعة بعد رد فعل انزيمي TET2، تم تحسين مقايسة حساسة LC-MS/MS المستندة إلى. تم رسم المنحنيات القياسية باستخدام عمليات تخفيف متسلسلة لخليط يحتوي على جميع النيوكليوسيدات.
تظهر هنا نتائج أسلوب الكروماتوغرافيا السائلة MS/MS. تسمح هذه الطريقة بالفصل وتحديد كمي قواعد الحمض النووي الأربعة العادية ، وكذلك قواعد السيتوسين الأربعة المعدلة. في هذا الإجراء التجريبي، نحن وصف استنساخ غير الموسومة الإنسان TET2 dioxynase المجال الحفاز باستخدام تقنية إعادة التركيب موقع محدد وتعبير كاف في متجه الوجهة في كولاي.
نحن تنقية بكفاءة غير الموسومة TET2 انزيم استخدام تبادل اللوني الموجبة لتحقيق أكبر من 90٪ نقاء في خطوة واحدة. علاوة على ذلك، قمنا بتطوير طريقة كروماتوغرافية سائلة جديدة لفصل قواعد الحمض النووي الأربعة العادية وقواعد السيتوسين الأربعة المعدلة. لتحديد كمية النيوكليوسيدات الثمانية من التفاعلات المحفزة TET2 ، قمنا بالاقتران مع أسلوبنا اللوني السائل المحسن مع قياس الطيف الكتلي.
ثم تم استخدام المقايسة الحساسة LC-MS/MS لتحديد نشاط إنزيم TET2 البشري غير المُعَد. النهج الموصوف هنا سيعزز إلى حد كبير من تقييم نوع البرية و متحولة TET2 الديوكسيجيناز.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا لتنقية الإنزيم البشري العشري العشري غير المميز (TET2) ثنائي أكسيد الكربون 5-ميثيل سيتوزين. يتم تحقيق التنقية من خلال طريقة كروماتوغرافيا تبادل الأيونات في خطوة واحدة، متبوعًا بفحص باستخدام كروماتوغرافيا السائلة-الطيف الكتلي المتسلسل (LC-MS/MS).
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم التخلق
- تنقيه البروتين
- الطيف الكتلي
الخلفية
- يشارك TET2 في إزالة الميثيل عن 5-ميثيل سيتوزين.
- فهم نشاط TET2 أمر بالغ الأهمية لدراسة التعديلات التخلقية.
- تسمح الطريقة بتحليل طفرات TET2 الطبيعية والسريرية.
- تنقيه TET2 الأصلي في خطوة واحدة يعد تقدمًا كبيرًا.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكول فعال لتنقية TET2.
- تحليل نشاط TET2 ومنتجاته.
- تسهيل البحث في مجال علم التخلق.
الطرق المستخدمة
- كروماتوغرافيا تبادل الأيونات لتنقية البروتين.
- كروماتوغرافيا السائلة-الطيف الكتلي المتسلسل (LC-MS/MS) لفحص النشاط.
- التحول البكتيري باستخدام خلايا E.coli BL21 DE3.
- عرض الإجراء من قبل طلاب الدراسات العليا.
النتائج الرئيسية
- تنقيه ناجح لـ TET2 غير المميز.
- تحليل نشاط TET2 من حيث تكوين المنتج.
- عرض الطريقة من قبل العديد من الباحثين.
- تطبيقات محتملة في دراسة طفرات TET2.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لتنقية TET2.
- يمكن أن يمكّن التحليل التفصيلي لنشاط TET2.
- يمكن أن يتقدم هذا النهج البحث في علم التخلق.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to evaluate wild-type and mutant TET2 dioxygenase activity with high precision, supporting target validation in epigenetic oncology. The single-step purification and LC-MS/MS assay provide quantitative, reproducible measurements of enzymatic function, facilitating mechanistic de-risking of TET2 as a therapeutic target in hematologic malignancies. By delivering scalable, standardized nucleoside profiling, the approach enhances predictive confidence in lead identification and preclinical target prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TET2 catalytic function through direct quantification of 5mC oxidation products (5hmC, 5fC, 5caC).
- Operational Value: Single-step cation exchange chromatography yields >90% pure untagged TET2, reducing purification complexity and batch variability.
- Predictive Value: LC-MS/MS separation of all eight DNA nucleosides allows accurate activity profiling of wild-type and clinical TET2 mutants for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: The LC-MS/MS method provides specific, sensitive detection of modified cytosine bases, enabling reliable compound screening against TET2 activity.
- Operational Value: Standard curves from nucleoside mixtures ensure quantitative accuracy and assay reproducibility across runs.
- Platform Value: Coupled liquid chromatography and tandem mass spectrometry creates a reusable platform for epigenetic enzyme characterization.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by quantifying TET2-dependent DNA demethylation intermediates in disease-relevant systems.
- Operational Value: Enables consistent activity measurement across wild-type and mutant TET2, aiding preclinical model selection.
- Risk Mitigation: Quantitative product formation data improves go/no-go decisions in target advancement by reducing mechanistic uncertainty.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through functional enzymatic assessment and enabling handoff to screening and preclinical teams via standardized activity readouts.
- Discovery Biology: Directly tests TET2 hypothesis by measuring oxidation of 5mC to 5hmC, 5fC, and 5caC, clarifying mechanistic function.
- Screening: LC-MS/MS output provides quantitative nucleoside profiles suitable for high-specificity compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Generates precise, separable measurements of eight nucleosides, enabling comparative analysis of enzyme kinetics and inhibition.
- Translational Research: Connects enzymatic activity to epigenetic modification states, supporting biomarker-relevant preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Purification and assay components are modular and scalable, allowing application across multiple TET isoforms or epigenetic targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking through direct, quantitative assessment of TET2 catalytic activity and product specificity.
- Operational Value: Standardized purification (>90% purity in one step) and LC-MS/MS detection ensure reproducibility and reduce technical variability.
- Strategic Value: Enables data-driven target prioritization by comparing wild-type and mutant enzyme activity profiles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions in epigenetic oncology programs by clarifying TET2 functional status.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, FPLC purification, and LC-MS/MS method development.
- Depends on access to cation exchange resins, mass spectrometers, and nucleoside standards for calibration.
- Necessitates cross-team standardization of reaction conditions, quenching, and DNA extraction protocols.
- Adaptation to other TET isoforms may require optimization of buffer conditions due to varying isoelectric points.
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on efficient DNA recovery and complete enzymatic digestion to nucleosides.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Cloning and Purification of Untagged Human TET2 Dioxygenase
5:30
5mC Oxidation by TET2 Dioxygenase
7:02
Quantitative Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)-based Assay Development
8:31
Results: Investigating the Role of the TET2 Enzyme in Normal Development and Disease
9:26
Conclusion
