تكلفة انخفاض مرونة نظام الزراعة المائية لتقييم استجابات النبات للجزيئات الصغيرة في ظروف معقمة

تم تحسين نظام الزراعة المائية في المختبر البسيط والمتعدد الاستخدامات والتكلفة المنخفضة بنجاح ، مما أتاح تجارب واسعة النطاق في ظل ظروف معقمة. يسهل هذا النظام تطبيق المواد الكيميائية في المحلول وامتصاصها بكفاءة من قبل الجذور للدراسات الجزيئية والكيميائية الحيوية والفسيولوجية. لقد أظهرنا أن هذا النظام كان عالي الكفاءة في الحصول على شتلات متجانسة على طول التطور الأولي ، وكذلك فصل الجذور والبراعم باستخدام بذور arabidopsis thaliana.

العناصر التالية ضرورية لبناء نظام الزراعة المائية وزراعة النباتات في ظل ظروف معقمة وخاضعة للرقابة. 7٪ إيثانول ، 10٪ محلول مبيض ، بولي سوربات 20 ، وسط MS بما في ذلك الفيتامينات. MES أحادي الهيدرات ، أجار ، هيدروكسيد البوتاسيوم.

غطاء التدفق الصفحي ، لوح التسخين ، غرفة النمو. صناديق بلاستيكية يمكن التخلص منها ، وأطباق بتري زجاجية معقمة ، وشريط لاصق ، وأطراف ماصة معقمة 200 و 300 ميكرولتر ، ومقص ، وماصة 300 ميكرولتر متعددة القنوات ، وماصة 200 ميكرولتر ، وشفرة مشرط ، وملاقط ، ورفوف طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. من الأهمية بمكان أن يكون لطرف الماصة المسطح مساحة ليتم ملؤها بالوسط الصلب.

قم بتعقيم رفوف أطراف الماصة بدون أغطية سيتم استخدامها كخزانات صغيرة في الأوتوكلاف عند 121 درجة لمدة 20 دقيقة. من أجل تجنب التلوث ، تم تعقيم جميع المواد المذكورة سابقا في الأوتوكلاف. عندما لم يكن ذلك ممكنا ، كما في حالة الصناديق البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة ، تم تنظيف المواد بنسبة 7٪ من الإيثانول قبل دخول غطاء التدفق الصفحي.

إذا سمح غطاء المحرك بذلك ، يمكن تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق قبل تجميع نظام الزراعة المائية. أغلق السطح العلوي لطرف الماصة بشكل مسطح بشريط لاصق. إذا أمكن ، اتركهم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق.

ثم أضف 108 ميكرولتر من الوسط الصلب المذاب في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. إذا كنت تقوم بإعداد العديد من الخزانات ، فاستخدم لوحا ساخنا لمنع وسط MS من التصلب. اترك الوسط يتماسك تماما ، حوالي 30 دقيقة.

خلال فترة التصلب ، يمكن تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. املأ صندوق الأطراف بالكامل بوسط الثقافة السائلة. ضمان التماسك الوثيق بين الوسائط الصلبة والسائلة.

قم بإزالة الأشرطة اللاصقة من السطح العلوي لطرف الماصة بشكل مسطح ، وقم بتثبيتها على الحامل بعناية. نظام الزراعة المائية جاهز الآن لاستقبال البذور المعقمة. يعد تعقيم التبييض السائل الموصوف هنا طريقة عملية لتعقيم البذور.

قبضة اليد ، ضع 500 بذرة أرابيدوبسيس في أنبوب صغير سعة 1.5 مل. استخدم أكبر عدد ممكن من الأنابيب الدقيقة حسب الضرورة وفقا لعدد النباتات المطلوبة للتجربة. اغسل البذور بنسبة 7٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين مع التحريض.

قم بإزالة الإيثانول بعناية. أضف مل واحد من محلول التبييض بنسبة 10٪ يحتوي على ميكرولتر من منظف بولي سوربات 20. حرك لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة المحلول بعناية. أخيرا ، شطف البذور بالماء المقطر المعقم حتى تتم إزالة جميع بقايا التبييض تماما ، حوالي خمس مرات. هذا البروتوكول ممكن لداء الأرابيدوبسيس ، ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا النظام للأنواع النباتية الأخرى.

تحقيقا لهذه الغاية ، يجب تعديل إجراء التعقيم المذكور وفقا لمتطلبات الأنواع. بعد التعقيم السطحي ، تم غمر البذور في الماء المقطر المعقم وتقسيمها إلى طبقات عند أربع درجات في الظلام لمدة خمسة أيام لمزامنة الإنبات. قم بقص طرف الماصة 200 ميكرولتر قليلا بمساعدة مشرط معقم.

قم بسحب بذور الأرابيدوبسيس في وسط الاستزراع الصلب على السطح العلوي لطرف الماصة بشكل مسطح. احرص على عدم ارتخاء الوسط من الشقة ، وإلا فإن البذور ستكون مظللة ولن تنمو الشتلات بشكل صحيح. قم بتخزين أكبر عدد ممكن من الخزانات الصغيرة داخل صندوق بلاستيكي يمكن التخلص منه للحفاظ على رطوبة عالية وبيئة خالية من الكائنات الحية الدقيقة.

أغلق الصندوق البلاستيكي القابل للتصرف باستخدام شريط لاصق. أنظمة الزراعة المائية جاهزة الآن لدخول غرفة النمو. تم تطوير هذا النظام المائي في البداية لتسهيل إعطاء المواد الكيميائية للنباتات ، مثل المركبات المسماة بالنظائر ، والتي بشكل عام مكلفة للغاية لتطبيقها في تجارب واسعة النطاق.

كدليل على المفهوم ، استخدمنا AZD8055 المثبط التنافسي ATP ، والذي يستهدف على وجه التحديد موقع ربط ATP لبروتين رابامايسين كيناز المستهدف. TOR كيناز هو منظم رئيسي يدمج استشعار المغذيات وإشارات الطاقة لتعزيز تكاثر الخلايا ونموها. من أجل تقييم الاستجابات الأولية لتثبيط TOR بوساطة AZD ، نمت بذور الأرابيدوبسيس في الماء حتى مرحلة النمو المرغوبة في أقل من 12 ساعة من فترة الصورة.

تم استبدال وسط طازج يحتوي على اثنين من micromolar AZD أو 0.05٪ DMSO كتحكم في الخزانات المائية في نهاية الليل. تم حصاد الشتلات في نقاط زمنية مختلفة بعد العلاج ، وفصلها إلى جذور وبراعم مجمدة في النيتروجين السائل ، وطحنها إلى مسحوق ناعم ، وتخزينها عند 80 درجة تحت الصفر حتى الاستخدام. نمط الفسفرة للبروتين الريبوسومي S6 كيناز ، RPS6 ، أحد الأهداف المعروفة لمسار TOR.

يظهر النشاف المناعي كمية RPS6 الكلي والفسفوري في الجذور ، والرسم البياني A ، والبراعم ، الرسم البياني B.حدث قمع الفسفرة في وجود ADZ855 في أقرب وقت بعد 30 دقيقة من العلاج بالعقاقير في كل من الجذور والبراعم ، مما يدل على أنه في ظل الظروف التجريبية المستخدمة ، أظهر ADZ أيضا أنه مثبط قوي ل TOR يقمع نشاط كيناز بسرعة. تقدم خطوط الأرابيدوبسيس المعدلة وراثيا مع انخفاض التعبير عن جين TOR أو مكونات مركب TOR نمطا ظاهريا واضحا للنشا الزائد. يكشف التحليل النوعي للنشا باستخدام محلول Lugol عن النمط المتوقع لتراكم النشا وتدهوره خلال الدورة.

تظهر الشتلات التي لم تتلق تطبيق MSO أو AZD855 تراكما أكبر للنشا في أوراقها في نهاية الليل ، وكان تراكم النشا في نباتات التحكم ، MSO ، متسقا مع الأدبيات. علاوة على ذلك ، قدمت النباتات المعالجة ب AZD كمية أكبر من النشا المتبقي في نهاية الليل مقارنة بالشتلات الضابطة. تشير هذه النتائج إلى فائدة نظام الزراعة المائية المقترح في زراعة الشتلات التي تحاكي الظروف الفسيولوجية.

يتراكم النشا في الأوراق أثناء النهار ، ويعاد تعبئته طوال الليل للحفاظ على أنشطة التمثيل الغذائي. في ظل الظروف العادية ، يبقى جزء صغير فقط من النشا ، بين 5 و 10٪ من الكمية الإجمالية بعد نهاية اليوم في نهاية الليل. تم اختبار هذه النتائج التي تشير إلى أن النمط الظاهري للنشويات الذي لوحظ تحت قمع TOR يحدث في جميع أنحاء الدورة.

تمت مقارنة النباتات المزروعة بالزراعة بالشتلات التي تنمو الركيزة البستانية في ظل ظروف ذروة متشابهة جدا فيما يتعلق بمستوى التعبير عن حمض الأبسيسيك لها عامل ربط عنصر استجابة ثلاثة ، جين ABF3 ، كما هو موضح في الشكل 5-A. يرتبط التعبير عن ABF3 ارتباطا مباشرا بمستويات ABA الداخلية ، وهي فئة من الهرمونات تعرف على نطاق واسع باسم علامة نظرا لدورها في استجابات الإجهاد اللاأحيائي المتعددة. على الرغم من أن النباتات المزروعة في الماء قدمت زيادة كبيرة في تعبير ABF3 عند مقارنتها بالنباتات المزروعة في التربة ، إلا أن مستويات التعبير عن سينثيتاز الأسباراجين واحد ASN1 ، لم تتأثر بمعالجات MSO أو AZD الموضحة في الشكل 5-B.

ومع ذلك ، فإن التعبير عن سينسيز فوسفات تريهالوز خمسة ، TPS5 ، بالإضافة إلى زيادة كبيرة بعد ثماني ساعات من قمع TOR. يستجيب ASN1 و TPS5 لمستويات السكر المنخفضة والمرتفعة على التوالي ، مما يشير إلى أن هذه النباتات لم تكن من ذوي الخبرة في الإجهاد الجيني. لقد نجحنا في استخدام هذا النظام لتقييم تطبيق الجزيئات الصغيرة في النباتات.

باختصار ، يمتلك نظام الزراعة المائية هذا العديد من المزايا لأنه سريع جدا وسهل التجميع ، وله تكلفة منخفضة ، حيث أن المكونات الرئيسية رخيصة الثمن ، ويمكن إعادة استخدامها على نطاق واسع. علاوة على ذلك ، فإن هذا النظام متعدد الاستخدامات ، مما يتيح دراسة الشتلات السليمة أو الفروق على طول تطور النبات ، وهو قابل للتطوير بدرجة كبيرة ، مما يسمح بزراعة عدد كبير من النباتات في مساحة صغيرة جدا.