Name: شاشة 2-هجين خميرة في دفعة المقارنة بين تفاعلات البروتين (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: تعلم تقنية التهجين المزدوج للخميرة في المقارنة المتوازية بين تفاعلات البروتين باستخدام التسلسل العميق. تُمكّن هذه الطريقة من تحديد التفاعلات البروتينية المختلفة ودراسة وظائف الجينات في العمليات الخلوية والجزيئية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن نشكر الموظفين داخل معهد "الوراثة البشرية" لإعداد مكتبة خ ع وتسلسلها. ونحن نشكر سنير آنيات لخبرتها في إعداد مكتبة الجينوم الشظايا لمكتبة بلازميد Y2H هنا. هذا العمل كان يدعمها في "المعاهد الوطنية للصحة": R21 المعاهد الوطنية للصحة EB021870-01A1 و "منحة مشروع بحوث جبهة الخلاص الوطني": 1517110.

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid%2C+a+powerful+tool+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li>
<li>Vidal, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+two-hybrid+assay%3A+still+finding+connections+after+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years.</a> Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).</li>
<li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li>
<li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li>
<li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li>
<li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).</li>
<li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrY2H-seq%3A+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li>
<li>Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+two-hybrid+affinity+data+with+in+vitro+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).</li>
<li>Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+yeast+two-hybrid+systems+using+the+interactions+of+bacterial+motility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins.</a> Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).</li>
<li>James, P., Halladay, J., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+libraries+and+a+host+strain+designed+for+highly+efficient+two-hybrid+selection+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast.</a> Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).</li>
<li>Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA and RNA.</a> CSH Protoc. 2007, pdb ip47(2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22485921">SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+using+chemiluminescent+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Western blotting using chemiluminescent substrates.</a> Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).</li>
<li>Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/">http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/</a> (2018).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).</li>
<li>Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p21+Cdk-interacting+protein+Cip1+is+a+potent+inhibitor+of+G1+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.</a> Cell. 75 (4), 805-816 (1993).</li>
</ol>

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

هنا نقدم دليل لكيفية إجراء فحوصات Y2H دفعة واحدة باستخدام طرق محسنة. وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في الإجراء للمساعدة على ضمان أن سكان الخميرة التي ستوضع تحت التحديد ممثل مكتبة البداية وأن ما يكفي من السكان الخميرة انطلاق يستخدم الخضوع للتحديد للحد من تقلب . الأهم من ذلك، هذه المقاييس سهلة نسبيا لتحقيق جنبا إلى جنب مع تكييف أساليب ومواد الإنزيم Y2H تقليدية، مما يجعل هذا النهج متاحة لمعظم المختبرات مجهزة للبيولوجيا الجزيئية القياسية. ديبن يسمح التحديد من السكان فريسة المكتبة نفسه أثناء استخدام البلازميدات الطعم مختلف...

فهم كامل للعمليات البيولوجية الخلية يعتمد على إيجاد شبكات التفاعل البروتين التي تكمن وراء تلك الآليات الجزيئية. يتمثل أحد النهج لتحديد تفاعلات البروتين المقايسة الخميرة 2-هجين (Y2H)، الذي يعمل عن طريق تجميع عامل نسخ تشيميريك تعمل بمجرد ربط بين البروتين المجالات ذات الاهتمام ببعضها1. شاشة Y2H نموذجية يتم عن طريق إنشاء عدد أن خميرة التي يضم كل مكتبة من البلازميدات ترميز البروتينات المتفاعلة التي تنصهر فيها منشط النسخي (مثلاً.، 'فريسة' البروتين الانصهار) وبلازميد معين 'طعم' تتألف من البروتين من مصلحة تنصهر إلى مجال ربط الحمض النووي (مثلاً، Gal4 الحمض النووي ملزم المجال الذي يربط إلى تسلسل تفعيل Gal4 المنبع). واحدة من المزايا الرئيسية للنهج الذي Y2H هو أن من السهل نسبيا وغير مكلفة لقواعد السلوك في مختبر نموذجية مجهزة للعمل الروتيني البيولوجية الجزيئية2. ومع ذلك، عندما تؤدي تقليديا، عينات مستخدم المستعمرات الفردية التي تنشأ عند التحديد لتفاعل إيجابي Y2H. وهذا يحد بشدة من عدد النسخ 'فريسة' المكتبة التي يمكن أن تجري دراسة استقصائية. وتتفاقم هذه المشكلة عند وفرة فريسة متفاعلة خاصة مرتفع جداً بالنسبة للآخرين، تتضاءل فرصة للكشف عن التفاعل من وفرة منخفضة فريسة والبلازميدات.
هو حل واحد لاستخدام مبدأ Y2H في تغطية شاملة للبروتين استخدام نهج المهيأة باستخدام مصفوفة حيث يمكن استجوابهم صفيف يحتوي على البلازميدات فريسة الفردية المعروفة رقمياً. ومع ذلك، يتطلب هذا نهج البنية أساسية التي لا يسهل موجوداً أو فعالة من حيث التكلفة للمحققين الأفراد الذين يرغبون في تحديد إينتيراكتومي لعدد قليل من البروتينات أو المجالات3. وباﻹضافة إلى ذلك، ستوسع المكتبات فريسة المعقدة جداً التي قد ترميز أجزاء متعددة من البروتينات المتفاعلة حجم هذه المصفوفات مصفوفة لأحجام غير عملي. وبديل هو إجراء فحوصات مع مكتبات المعقدة على دفعات وتقييم وجود المتفاعلة الحيوانات المستنسخة باستخدام التسلسل الفائق المتوازية الضخمة4. وهذا يمكن تطبيقه على الاعتداء وجود والبلازميدات الجارحة التي تنشأ في مستعمرات متعددة باستخدام نموذجي Y2H نهج يسمح لتنمو على5،لوحة6خلايا الإسكان على زوج متفاعلة من البروتينات الانصهار في الخميرة التي تمت تهيئتها. يمكن أن تتفاقم هذه الفكرة العامة لزيادة الاستعلام من كلا الطعم متعددة وفريسة المكونات في نفس الوقت7،8.
لا يزال العديد من التحقيقات تتطلب أسهل بعد أكثر تركيزاً الجهد على عدد قليل من البروتين 'الطعم' ويمكن أن تستفيد أكثر من استعلام حصرية وشبه كمي لمكتبة واحدة فريسة المعقدة. لدينا نمواً والتحقق من صحة نهج لإجراء دراسات التفاعل البروتين على نطاق واسع باستخدام مبدأ Y2H في دفعة الشكل4. هذا يستخدم معدل التوسع بلازميد فريسة معينة كوكيل للقوة النسبية ل التفاعل Y2H9. التسلسل العميق لجميع البلازميدات داخل مجموعة من سكان يتعرضون للنمو الطبيعي أو ظروف النمو الانتقائي وتنتج خريطة كاملة للحيوانات المستنسخة التي تسفر عن التفاعلات Y2H القوية والضعيفة. ويمكن الحصول على المرجع للتمثيلات ومقارنة مباشرة عبر متعددة الطعم والبلازميدات. وبالتالي يمكن استخدام سير العمل الناتجة عن وصف ديبن (التخصيب الحيوي لشبكات التقييم البروتين) لتحديد إينتيراكتوميس التفاضلية من نفس مكتبات فريسة لتحديد البروتينات، مما يتيح المقارنة بين بروتين واحد مقابل آخر.
وهنا نبدي ديبن وإدخال التحسينات في أساليب المختبرات التي يسهل استخدامها، الذي يرد في الشكل 1. تتضمن التحسينات الهامة:
جيل سكان فريسة الخميرة. أحد المتطلبات الرئيسية ديبن يولد سكان خميرة مع البلازميدات الطعم المختلفة التي لها نفس التوزيع للمكتبات فريسة بلازميد. السكان يعادل خط الأساس للمكتبة بلازميد فريسة ضرورية لإجراء مقارنات دقيقة بين إينتيراكتوميس الطعوم المختلفة. وهذا يتحقق على أفضل وجه عندما يقع بلازميد مكتبة الفعل في عدد سكان فرداني خميرة وتتحرك بلازميد طعم معطى إلى أن السكان يتحقق عن طريق التزاوج لإنتاج من مثنوية. وهنا، نحن نقدم دليل واضح في كيفية جعل هؤلاء السكان باستخدام المكتبات التجارية في الخميرة فرداني. على الرغم من أن نجد أساليب توليد عدد كبير من ديبلويدس، وكفاءة التزاوج عموما من هذه السلالات التجارية الخميرة التي تحتوي على مكتبة كان منخفضا. ولذلك، نحن شيدت سلالة جديدة التي يمكن البيت فريسة المكتبات التي تعطي ديبلويدس أكثر بكثير من كل رد فعل التزاوج.
مجموعة جديدة من الطعم والبلازميدات. العديد من البلازميدات الحالية التي تعبر عن 'الطعم' الانصهار البروتينات تتألف من البروتين الفائدة ومجال الحمض النووي ملزم تقوم على أساس 2µ، السماح لهم بتضخيم عدد النسخ. يمكن هذا الرقم نسخة متغير تماما في عدد السكان ويؤدي إلى تباين في استجابة النسخي Y2H. وهذا بدوره يمكن أن تحرف القدرة على قياس قوة تفاعل بروتين معين استناداً إلى استجابة نمو الخلايا ضمن التحديد. يمكن أن يكون هذا جزئيا إلى عنوان باستخدام بلازميد نسخة منخفضة، البعض منها قد وصفت سابقا مثل pDEST32 المتاحة تجارياً10. نحن شيدت بلازميد طعم جديد (بتيف-اختطارها) التي تنتج Gal4-الحمض النووي-ملزمة المجال الانصهار البروتينات داخل بلازميد نسخة منخفضة على أساس السنترومير TRP1 تحمل الجينات المقاومة كانر أن يسمح أيضا باستنساخ الأجزاء الطعم المنبع و المتلقين للمعلومات في المجال Gal4 الحمض النووي ملزم.
مكتبة بلغة جديدة الكثافة Y2H. شيدت بلازميد جديد إلى البيت Y2H فريسة المكتبات، وأنها تستخدم لبناء مكتبة Y2H معقدة للغاية مصنوع من شظايا المنفصمة عشوائياً من الحمض النووي من Saccharomyces cerevisiae. أظهر تحليل تسلسل أن مكتبة هذه العناصر المختلفة ما يزيد على 1 مليون، الآن أكثر تعقيداً من الخميرة هو موضح سابقا المجينية Y2H بلازميد المكتبات11. مع هذه المكتبة الجديدة، كنا قادرين على إظهار أن يكون سير العمل ديبن قوية بما يكفي لاستيعاب مكتبات معقدة مع العديد من البلازميدات مختلفة على نحو يعول عليه وقابل لإعادة الإنتاج.

<table><tbody><tr><td>منصة التسلسل العميق Illumina HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل HA</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>الجسم المضاد الأساسي للكشف عن التعبير عن حمض الهيالوروناليك في pGal4AD يبني</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة ل myc</td><td>QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>الجسم المضاد الأساسي للكشف عن التعبير عن MYC في pTEF-GBD يبنيات</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>نيو إنجلاند BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>نيو إنجلاند BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>نيو إنجلاند BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>البولي إيثيلين جلايكول 3350 ، مسحوق</td><td>JT Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>سمك السلمون المنوية DNA</td><td>Trevigen، Inc المباعة بواسطة Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>الحمض النووي الحامل لتحويل الخميرة القسم 3.2.1.</td></tr><tr><td>منتجات أبحاث Kanamycin Monosulfate</td><td>International</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>المستخدمة في صنع المواد الهلامية للحمض النووي</td></tr><tr><td>agarose منتجات أبحاث كلوريد الصوديوم</td><td>الدولية</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>منتجات أبحاث التربتون</td><td>الدولية</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Research Products International</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>خلات الليثيوم ثنائي هيدرات</td><td>MP الطب الحيوي</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA منتجات أبحاث ملح الصوديوم</td><td>الدولية</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>مسحوق مستخلص الخميرة</td><td>منتجات الأبحاث الدولية</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>قاعدة نيتروجين الخميرة (كبريتات الأمونيوم) بدون الأحماض</td> <td>الأمينيةمنتجات البحوث الدولية</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-Leu + 40ADE</td><td>فورميد</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-Leu-HIS + 40ADE</td><td>للمتوسط</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu-Met</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-Met</td><td>Bio 101، Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>منتجات أبحاث الأدينين</td><td>الدولية</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) - منتجات أبحاث الجلوكوز</td><td>الدولية</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>المستخدمة في صنع لوحات الوسائط في القسم 1</td></tr><tr><td>منتجات أبحاث</td><td>الببتون</td> الدولية <td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-أمينو-1،2،4 تريازول</td><td>سيجما</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2- Mercaptoehanol (BME)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>زيموليز 100T</td><td>USBiological</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة</td><td>سيجما</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>الفينول: الكلوروفورم: IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>أسيتات الأمونيوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>238074</td><td></td></tr><tr>مختبرات<td>الإيثانول</td><td>ديكون ، INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>منتجات أبحاث اليوريا</td><td>الدولية</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>منتجات الأبحاث الدولية</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>الجلسرين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>تريس حمض الهيدروكلوريك</td><td>جيبكو</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>بروموفينول أزرق</td><td>أمريسكو</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة استنساخ تجميع جيبسون</td><td>نيو إنجلاند بيولابز</td><td>E5510S</td><td>طريقة التجميع السريع لاستنساخ البلازميدات في القسم 2</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>المستخدمة لتضخيم المنتجات لتجميع جيبسون في القسم 2.3 بالإضافة إلى تحضير العينة للتسلسل العميق DEEPN في القسم 6.2.1</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>طقم تنقية QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>يستخدم لتنقية منتجات PCR في القسم 6.2.3</td></tr><tr><td>مجموعة استخراج هلام الحمض النووي</td><td>Qiaquick Qiagen</td><td>28704</td><td>تستخدم لتنقية pTEF-GBD المهضوم في القسم 2.1</td></tr><tr><td>مجموعة KAPA Hyper Prep</td> مجموعة تحضير <td>KAPA Biosystems</td><td>KK8500</td><td>للتسلسل العميق</td></tr> تحسين <tr><td>الكودون</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>تحسين الكودون</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks</td><td>تقنيات الحمض النووي</td><td></td> المتكاملة <td>شظايا الحمض النووي المستخدمة في الاستنساخ في القسم 2.2</td></tr><tr><td>سلاسل</td> شظايا الحمض النووي <td>للرماشر</td><td></td><td>الحراري المستخدمة للاستنساخ في القسم 2.2</td></tr><tr><td>مجموعة إعداد الحمض النووي البلازميد GenCatch</td><td>EPOCH Life Sciences</td><td></td><td>المستخدمة لتحضير كميات من الحمض النووي في القسم 2.3</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>عالية الأداء فوق صوتي في القسم 7</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3 '</td><td>تقنيات الحمض النووي المتكاملة أو Thermofisher</td><td></td><td>المستخدمة لتضخيم PCR وتسلسلها 5 'إدراج pTEF-GBD أثناء بناء البلازميد</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3'</td><td>تقنيات الحمض النووي المتكاملة أو Thermofisher</td><td></td><td>المستخدمة لتضخيم وتسلسل PCR 5 'إدراج pTEF-GBD أثناء بناء البلازميد</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-CACCGTAT TTCTGCCTCTTCC-3'</td><td>تقنيات الحمض النووي المتكاملة أو Thermofisher</td><td></td><td>المستخدمة لتضخيم وتسلسل PCR 3 'إدراج pTEF-GBD أثناء بناء البلازميد</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3'</td><td>تقنيات الحمض النووي المتكاملة أو Thermofisher</td><td></td><td>المستخدمة لتضخيم PCR وتسلسلها 3 'إدراج pTEF-GBD أثناء بناء البلازميد</td></tr><tr><td>قليل النوكليوتيدات 5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3'</td><td>تقنيات الحمض النووي المتكاملة أو Thermofisher</td><td></td><td>5 'Pimer المستخدمة لتضخيم pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3'</td><td>تقنيات الحمض النووي المتكاملة أو Thermofisher</td><td></td><td>3 'Pimer المستخدمة لتضخيم إدراج pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3'</td><td>تقنيات الحمض النووي المتكاملة أو Thermofisher</td><td></td><td>5 'Pimer المستخدمة لتضخيم إدخال pGADT7</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3'</td><td>تقنيات الحمض النووي المتكاملة أو Thermofisher</td><td></td><td>3 'Pimer المستخدمة لتضخيم إدراج سلالة الخميرة pGADT7</td></tr><tr><td>PJ69-4A MatA</td><td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P و Halladay J و Craig EA: المكتبات الجينومية وسلالة مضيفة مصممة لاختيار هجينين عالي الكفاءة في الخميرة. علم الوراثة 1996 144: 1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3،112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D ، gal80D ، GAL-ADE2 lys2 :: GAL1-HIS3 met2 :: GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>الدكتور روبرت بايبر لاب</td><td></td><td>Gal4-DNA ربط دويمان التعبير البلازميد</td></tr><tr><td>pGal4AD (pPL6343)</td> <td>الدكتور روبرت بايبر لاب</td><td></td><td>Gal4 التعبير عن مجال التنشيط Gal4 بلازميد</td></tr><tr><td>100 مم أطباق بتري</td><td>Kord-Vallmark المباعة بواسطة VWR</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>125 مل قارورة PYREX Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>250 مل قارورة PYREX Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1,000 مل قارورة PYREX Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>2,000 مل قارورة PYREX Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>20 × 150 مم أنبوب ثقافة يمكن التخلص</td> منه <td>Thermofisher</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>الماصة</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>5 مل الماصة المصلية</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 مل ماصة مصلية</td><td>Denville</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 مل ماصة مصلية</td><td>Denville</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1,000 مل PYREX Griffin Beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1,000 مل PYREX زجاجة تخزين الوسائط القابلة</td> لإعادة <td>الاستخدام فيشر ساينتفيك</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1,000 مل أسطوانة متدرجة</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>الأجهزة</td><td></td> الجزيئية <td>المستخدمة لقياس الكثافة البصرية للخلايا</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td> مقياس <td>الطيف الضوئي المستخدم لتحديد كمية الأشعة فوق البنفسجية الإلكترونية للحمض النووي</td></tr><tr><td> يستخدم transilluminator</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td><td>لتصور الحمض النووي في هلام الاغاروز Ethidium Bromide</td></tr><tr><td>P1000 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 & ميكرو; L نصائح ماصة منخفضة الاحتفاظ</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro; LLow الاحتفاظ بأطراف الماصة</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro; L XL منخفضة الاحتفاظ بأطراف الماصة</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>50 مل أنبوب مخروطي</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>15 مل أنبوب مخروطي</td><td>VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>مكشطة</td><td>خلية دنفيل Scientific</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>1.5 مل أنابيب الطرد المركزي</td><td>الدقيقة الولايات المتحدة الأمريكية العلمية</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>فلوكا التحليلي</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>أدوات التطبيق الخشبية</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf أجهزة الطرد المركزي الدقيقة 5424</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>05-400-005</td><td>أجهزة الطرد المركزي</td></tr><tr><td>الدقيقة Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td> أجهزة <td>الطرد المركزي</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG ، مرتبطة ب HRP بالكامل Ab (من الحمار)</td> <td>GE الرعاية الصحية</td><td>NA934-1ML</td><td>الجسم المضاد الثانوي</td></tr><tr><td>Amersham ECL Mouse IgG ، المرتبط ب HRP كامل Ab (من الأغنام)</td> <td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>الأجسام المضادة الثانوية</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico الركيزة</td> الكيميائية <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td>حل الكشف عن ECL</td></tr><tr><td>حاضنة Isotemp</td><td>حاضنة Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>حاضنة</td></tr><tr><td>Mutitron 2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>حاضنة اهتزاز</td></tr><tr><td>Isotemp Digital-Control حمام مائي نموذج 205</td> حمام <td>مائي</td><td>علمي</td><td></td></tr><tr><td>فيشر مكتبة ماوس CDNA Y2H في Y187 (أنسجة عموم)</td> <td>مكتبة CDNA (cDNA</td>) المتوفرة <td>630482 تجاريا</td><td></td>مكتبة</tr><tr><td>cDNA Y2H للماوس في Y187 (دماغ الفأر)</td><td>مكتبة CDNA 630488 المتوفرة</td><td></td><td>تجاريا (cDNA</td></tr>) <tr><td>pGADT7 AD Vector</td><td>Clontech</td><td>630442</td><td>AD Vector المتاح تجاريا يضم العديد من مكتبات (كدنا)</td></tr><tr><td>pGBKT7 DNA-BD Vector</td><td>Clontech</td><td>630443</td><td>الحمض النووي المناقلات</td></tr><tr><td>Biolase DNA Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21042</td><td>DNA polymerase المستخدمة في القسم 2.4</td></tr><tr><td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60</td><td>آلة pcr</td></tr><tr><td>TempAssure 0.5 مل أنابيب PCR</td><td>الولايات المتحدة الأمريكية العلمية</td><td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

شاشة 2-هجين خميرة في دفعة المقارنة بين تفاعلات البروتين

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

الفحص لتفاعلات البروتين البروتين باستخدام مقايسة 2-الهجين الخميرة منذ فترة طويلة أداة فعالة، ولكن إلى حد كبير استخدام محدود لاكتشاف التمثيلات النسب العالية التي يتم التخصيب في مكتبة المرشحين المتفاعلة. في تنسيق تقليدية، يمكن أن تسفر عن التحليل 2-الهجين الخميرة مستعمرات كثيرة جداً لتحليل عندما أجرت في صرامة منخفضة حيث يمكن العثور على التمثيلات تقارب منخفضة. وعلاوة على ذلك، دون استجواب شاملة وكاملة من المكتبة نفسها ضد والبلازميدات الطعم مختلفة، لا يمكن تحقيق إجراء تحليل مقارن. على الرغم من أن بعض هذه المشاكل يمكن معالجتها استخدام مكتبات صفت فريسة، التكلفة والبنية التحتية اللازمة لتشغيل هذه الشاشات يمكن أن تكون باهظة. كبديل لذلك، ونحن قد تكيفت المقايسة 2-الهجين الخميرة في الوقت نفسه كشف العشرات من عابرة وتفاعلات البروتين ثابتة داخل شاشة واحدة استخدام استراتيجية وصف ديبن (التخصيب الحيوي لشبكات التقييم البروتين)، التي ويتضمن تسلسل الحمض النووي الفائق وحساب متابعة تطور عدد سكانها والبلازميدات ترميز الشركاء متفاعلة فيما بينها. وهنا يصف لنا الكواشف مخصصة والبروتوكولات التي تسمح شاشة ديبن ليتم تنفيذها بسهولة وفعالية من حيث التكلفة.

الإنزيم Y2H وقد استخدمت على نطاق واسع لإيجاد تفاعلات البروتينات: البروتين، وقد وضعت عدة تكييفات ونظم. معظمها، أن نفس الاعتبارات التي تساعد على ضمان نجاح هذه النهج السابقة تعتبر هامة ديبن. بعض المعايير الهامة تشمل: ضمان التعبير عن مجال الحمض النووي ملزم البروتينات الانصهار، ضمان خلفية منخفضة زائفة له + النمو في ديبلويدس التي تحتوي على الطعم يحظى باهتمام بلازميد فريسة فارغة، كفاءة عالية التزاوج من الطعم التي تحتوي على الخميرة ماتا مع المكتبة التي تحتوي على الخميرة ماتالفا، وأخيراً، ظروف الت...

تجهيز دفعة من الخميرة 2-الهجين شاشات تسمح بالمقارنة المباشرة لملامح متعددة الطعم البروتينات التفاعل مع مجموعة معقدة جداً من البروتينات الانصهار فريسة. هنا، يمكننا وصف الأساليب المكررة، الكواشف الجديدة، وكيفية تطبيق استخدامها لهذه الشاشات.

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

تستخدم هذه الطريقة مبدأ نظام الخميرة 2-الهجين في كلا المجموعتين لتحديد تفاعلات البروتين والبروتين التي تجيب على الأسئلة الرئيسية حول مجموعة متنوعة من العمليات الجزيئية والخلوية. تستفيد هذه التقنية من التسلسل العميق لمعرفة تفاعلات بروتين مقابل آخر. نظرا لأن هذا النهج موجه لإجراء مقارنات متوازية ، يمكنه تحديد مجموعات البروتينات التي تتفاعل مع بروتين مقابل آخر أو تأكيدات مختلفة لنفس البروتين أو أثناء كتابة مرض يسبب نسخة متحولة ، للكشف عن التفاعلات التفاضلية.تم إنشاء بلازميد جديد للخميرة 2-هجين pTEF-GBD لهذا الإجراء كما هو موضح في بروتوكول النص. ينتج هذا البلازميد بروتينات اندماج مجال ربط الحمض النووي Gal4 داخل بلازميد منخفض النسخ قائم على سنترومير TRP1 يحمل جين مقاومة الكاناميسين الذي يسمح أيضا باستنساخ شظايا الطعم في المنبع واتجاه مجرى المجال المرتبط بالحمض النووي Gal4. تم استخدام بلازميد الطعم هذا لتحويل خميرة MATa ، وتم التحقق من التعبير عن بروتينات اندماج الطعم Gal4 عن طريق النشاف المناعي بالأجسام المضادة المضادة ل MIC.بالإضافة إلى ذلك ، تم إنشاء مكتبة جديدة للخميرة 2-hybrid في ناقل البلازميد الفريسة المبسط PGAL4 AD. تم تجزئة الحمض النووي الجيني عن طريق القص ، وتحديد الحجم ، والتعديل باستخدام المحولات ، وإدخاله في PGAL4-AD لإنشاء مكتبة saxairtab yeast 2-hybrid. لبدء إجراء إنشاء مجموعات الخميرة بمكتبات الطعم والفرائس ، قم بتلقيح ثلاثة مليلتر من كل من محولات خميرة MATa التي تحمل الرحلة المختلفة التي تحتوي على بلازميدات الطعم و CSM ناقص وسط الرحلة.قم بتضمين ثقافتين منفصلتين ، تحتوي على البلازميد الناقل وحده ، لتكون بمثابة ضوابط إجرائية. احتضان الثقافات عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة ست ساعات. ثم قم بتخفيف كل ثقافة في مزرعة 25 مليلتر في قارورة Erlenmeyer معقمة واحتضانها طوال الليل.قم بإذابة حقير مجمد من خلايا ألفا MAT التي تحتوي على مكتبة الفرائس الحاملة ل lu2 في درجة حرارة الغرفة. استخدم الخلايا الذائبة بالكامل لتلقيح 125 مل من CSM ناقص لو ناقص متوسط التقى في قارورة Erlenmeyer معقمة. قم بزراعة الثقافة عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.في اليوم التالي ، بعد التأكد من أن OD600 من الثقافات المحولة بين 1.0 إلى 1.5 ، قم بنقل المزارع إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر ومكافئ أجهزة الطرد المركزي 21 OD 600 لكل مزرعة عند 4 ، 696 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أعد تعليق كل حبيبات من خلايا حصيرة في 10 ملليلتر من الماء المعقم ، ونقل التعليق إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر ، وجهاز طرد مركزي عند 4 ، 696 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. باستخدام ماصة ، قم بإزالة المادة الطافية برفق ، دون تعطيل الخلايا المحببة ، وأعد تعليق الحبيبات في أربعة ملليلتر من وسط YPDA المخزن عند درجة الحموضة 3.7.لكل 10 تفاعلات تزاوج مرغوبة ، بيليه 39 OD 600 مكافئ لسلالة ألفا الحصيرة التي تحمل بلازميدات المكتبة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. أعد تعليق خلايا ألفا الحصيرة في 10 مل من الماء المعقم وأعد الحبيبات في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر عند 4 ، 696 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. باستخدام ماصة ، قم بإزالة المادة الطافية برفق ، دون تعطيل الخلايا المحببة ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من وسط YPDA المخزن عند درجة الحموضة 3.7.لإعداد كل تفاعل تزاوج ، أضف ما يلي إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل: مليلتر واحد من الخلايا المحولة MAT-A ، ومليلتر واحد من مكتبة MAT-alpha التي تحتوي على خلايا ، ومليلتر واحد من YPDA المخزن عند درجة الحموضة 3.7. احتضن عند 30 درجة مئوية مع تحريك مداري لطيف لمدة 90 دقيقة. بعد 90 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 4،696 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من واحد إلى واحد YPDA-YPD المخزن مؤقتا. ضع كل ملليلترين من الخلايا على صفيحة YPD سعة 100 مل واحتضنها عند 30 درجة مئوية لمدة 20 ساعة تقريبا. لحصاد الخلايا ، قم بتقطيع ماصتين إلى ثلاثة ملليلترات من CSM مطروحا منه لو ناقص وسط الرحلة على كل لوحة YPD واستخدم مكشطة خلية لطرد الخلايا.ماصة الخلايا المخلوطة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. اشطف اللوحة أربع إلى خمس مرات باستخدام ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من CSM ناقص lu ناقص وسط الرحلة باستخدام ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لرفع الماصة وإخراجها برفق عبر سطح لوحة YPD. الطرد المركزي للخلايا عند 4،696 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.تخلص من المادة الطافية من كل أنبوب مخروطي الشكل وأعد تعليق الخلايا في 40 مل من CSM ناقص لو ناقص وسط الرحلة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. لتقدير عدد الخلايا ثنائية الصبغيات المتكونة ، قم بتخفيف أربعة ميكرولترات من الخليط ثنائي الصبغيات إلى 200 ميكرولتر و 2 ، 000 ميكرولتر من CSM ناقص لو ناقص وسط الرحلة ، على التوالي. لوحة 200 ميكرولتر من كل تخفيف على CSM ناقص lu ناقص لوحة رحلة لتمثيل واحد إلى 10،000 وواحد إلى 100،000 تخفيف كامل من مخزون ثنائي الصبغيات المحصودة.احتضن الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 36 إلى 40 ساعة. استخدم على الفور ما تبقى من كل 40 مل من إعادة تعليق الخلية لتلقيح 500 مل من CSM ناقص لو ناقص وسط رحلة في قارورة Erlenmeyer سعة لتر واحد. قم بقياس OD 600 لكل ثقافة.احتضان هذه القوارير عند 30 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 180 دورة في الدقيقة ، حتى تصل إلى التشبع ، والذي يستغرق عادة من 36 إلى 40 ساعة. راقب نمو الخلايا في 24 ساعة و 36 ساعة عن طريق قياس OD 600. قبل الاستمرار في الإجراء ، تأكد من كفاءة التزاوج لسلالات الخميرة.مطلوب عدد لا يقل عن 200 مستعمرة على لوحة التخفيف من واحد إلى 10،000. بمجرد أن تصل الثقافات إلى التشبع ، استخدم ماصة لإزالة 20 مليلتر من كل مزرعة وتلقيح قوارير إرلينماير سعة لترين. قارورة واحدة تحتوي على 750 مل من CSM ناقص لو ناقص وسط الرحلة وقارورة ثانية تحتوي على 750 مل من CSM ناقص لو ناقص الرحلة مطروحا منه متوسطه.مع أدنى مستوى من ثلاثة أمينو 124 تريازول يزيل الخلفية ، والتي تم تحديدها مسبقا كما هو موضح في بروتوكول النص. امزج الثقافات الجديدة جيدا عن طريق الدوران. بعد قياس OD 600 الأولي ، احتضان الثقافات عند 30 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 180 دورة في الدقيقة ، حتى التشبع ، والذي يحدث عادة في غضون 24 ساعة ل CSM غير المحدد ناقص lu ناقص ثقافة الرحلة ، ولكن يمكن أن يستغرق أكثر من 70 ساعة للثقافات قيد الاختيار للتفاعلات الهجينة 2 للخميرة.بمجرد أن تصل المزارع إلى التشبع ، قم بإزالة 11 مل من كل مزرعة بواسطة الماصة وقم بترسيب الخلايا بدوران لمدة خمس دقائق عند 4،696 مرة جم في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية واستمر في استخراج الحمض النووي كما هو موضح في القسم التالي. لبدء إجراء استخراج الحمض النووي ، استخدم ماصة لإعادة تعليق كل حبيبات خلية تم تحضيرها مسبقا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت القوي للطاقة المعيشية والغازية.انقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وأضف 10 ميكرولترات من مخزون زيمولاي إلى كل أنبوب. في غطاء الدخان ، أضف ثلاثة ميكرولترات من بيتا ماركيتول إيثانول إلى كل أنبوب واخلطه جيدا. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 36 ساعة.بعد ذلك ، استخرج العينات مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من الكحول المتساوي المحلول من كلوروفورم الفينول كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف سبعة ميكرولترات من أربعة كلوريد صوديوم مولي و 900 ميكرولتر من المثلج البارد و 100٪ الإيثانول واخلطها عن طريق الانعكاس. قم بترسيب الحمض النووي عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي دقيق عند 21 ، 130 مرة جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.تخلص من المادة الطافية عن طريق سحب العينة واغسل كل حبيبات ثلاث مرات ب 900 ميكرولتر من 70٪ إيثانول. قم بترسيب الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي عند 21 ، 130 مرة جم لمدة دقيقتين. بعد إزالة الإيثانول المتبقي ، جفف الكريات عند 42 درجة مئوية لمدة سبع دقائق.أعد تعليق كل حبيبات في 120 ميكرولتر من 0.1x TE قوي في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. ماصة 60 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 ملليلتر. أضف 120 ميكرولترا من TE القوي و 3.5 ميكرولتر من مخزون RN ace A ، ونقر للخلط ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.أضف سبعة ميكرولترات من خمسة أسات الأمونيوم المولي و 900 ميكرولتر من المثلج البارد ، 100٪ إيثانول لكل أنبوب. امزج عن طريق الانعكاس وترسيب الحمض النووي ، كما هو موضح سابقا. أعد تعليق الحمض النووي المعالج RNace-A في 55 ميكرولتر من TE قوي 0.1x في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.حدد كمية الحمض النووي عن طريق الامتصاص عند 260 نانومتر. الخطوة التالية هي إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على إدخالات CDNA. قم بإجراء تفاعلين PCR سعة 50 ميكرولتر لكل عينة من الحمض النووي.أضف الماء إلى كل تفاعل ، خمسة ميكروغرامات من عينة الحمض النووي ، و 25 بيكامول من كل برايمر أمامي وعكسي يطابق بلازميد مكتبة الفريسة ، و 25 ميكرولترا من مزيج رئيسي عالي الدقة 2x PCR. تضخيم ردود الفعل مع هذا البرنامج. إزالة طبيعة لمدة 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ، و 25 دورة من D-natrine عند 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، وتهوية عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، وأوقات تمديد لمدة ثلاث دقائق عند 72 درجة مئوية ، تليها حضانة لمدة خمس دقائق عند 72 درجة مئوية.قم بتحليل كل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة الرحلان الكهربائي للبرودة agrose بنسبة 1٪ باستخدام هلام يحتوي على الأثيريومبرومين وتصور الجل عن طريق الأشعة فوق البنفسجية. تظهر العينات بدون اختيار مسحة عامة للحمض النووي ، ولكن عند الاختيار يمكن تمييز النطاقات الفردية. اجمع بين عينات PCR المكررة وقم بتنقيتها باستخدام مجموعة باتباع تعليمات الشركة المصنعة.حدد كمية الحمض النووي عن طريق الامتصاص عند 260 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي. بعد ذلك ، قم بإجراء تسلسل عميق ، متبوعا بمعالجة المعلوماتية الحيوية والتحقق منها كما هو موضح في بروتوكول النص. تم استخدام مكتبة الخميرة المجزأة العشوائية الجديدة 2-hybrid في الإجراء المثبت وتم تحليل إدخالات البلازميد التي تم تضخيمها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق تسلسل DEEP ومعالجة المعلوماتية الحيوية باستخدام برنامج DEEPN ومقارنتها بمكتبة منشورة سابقا.توضح هذه المؤامرة ترتيب ترتيب القصب لكل جين في المكتبات مقسومة على القصب لكل جين تم العثور عليه عن طريق تسلسل جينوم الخميرة. يوضح هذا الرسم البياني عدد البلازميدات الفريدة لكل جين يشفر جزءا موجودا في منطقة ترميز البروتين وفي إطار القراءة الانتقالي المناسب. يتم عرض مقارنة بين أعداد البلازميدات المختلفة في كل مكتبة التي تشفر جينات الخميرة والنسبة الموجودة وغير الموجودة في إطار القراءة الانتقالي الصحيح أو التي يتم إدخالها للخلف.بشكل عام ، تحتوي المكتبة الجديدة على العديد من البلازميدات المختلفة. تضمن هذه الطرق إمكانية نقل المكتبة بشكل متكرر إلى خلايا تحتوي على بروتينات طعم مختلفة وأن إجراء الاختيار يمكن أن ينتج مجموعات قابلة للتكرار من الجينات المخصبة ، مما يميزها على أنها بروتينات محددة تتفاعل مع المرشح. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أسبوع تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.معظم هذا العمل هو احتضان ثقافات الخلايا والوقت العملي في الواقع هو بضع ساعات فقط. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إنشاء مجموعات من عدد كبير من الخلايا ثنائية الصبغيات الفردية بحيث يمكن نقل المكتبة بشكل متكرر إلى الخلايا التي تحتوي على بروتينات الطعم المختلفة. من المهم أيضا إيلاء اهتمام وثيق لظروف التخفيف ومعدل نمو الخلايا لتلك المجموعات التي تخضع للاختيار لظروف الخميرة الإيجابية 2-الهجينة.باتباع هذا الإجراء ، ستحدد الطرق الحسابية التي يتم شرحها في العمل المصاحب البروتينات المتفاعلة المرشحة وتوفر مسارا للتحقق من صحة هذه التفاعلات باستخدام مقايسة الخميرة التقليدية الهجينة 2 أو طرق كيميائية حيوية أخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة جدا عن كيفية إنشاء مجموعات خميرة ثنائية الصبغيات بشكل متكرر تحتوي على مكتبة البلازميد الفريسة وتنميتها دفعة واحدة لاختيار تفاعلات الخميرة الإيجابية 2-hybrid. لا تنس أن العمل مع المذيبات العضوية ، أثناء بروتوكول تنقية الحمض النووي ، يمكن أن يكون خطيرا ويجب أن يتم في غطاء الدخان مرتديا قفازات ومعطف مختبر.

a-yeast-2-hybrid-screen-in-batch-to-compare-protein-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

الأسطورة يسمح للكشف حساسة للتفاعلات عابرة ومستقرة بين البروتينات التي يتم التعبير عنها في البيرة الكائن السكيراء النموذج. وقد تم تطبيقه بنجاح لدراسة خارجية والخميرة بروتينات الغشاء لا يتجزأ من أجل تحديد شركائهم التفاعل بطريقة إنتاجية عالية.

انقسام اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام : أداة قوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات

قمنا بتطوير شامل وغير متحيز الجينوم واسعة لفهم الجينات شاشات المخدرات وتفاعلات الجينات والبيئة. وتعرض وسائل للكشف عن هذه المجموعات متحولة.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

يوضح هذا الفيديو اختبار الخميرة الهجينة للكشف عن تفاعلات ذاتية معينة للبروتين. في هذا الاختبار ، يتم تمييز البروتين محل الاهتمام بمجالين من عامل النسخ الذي يشفر إنزيم β-galactosidase. عندما يتفاعل البروتينان ، يؤدي ذلك إلى تكوين الإنزيم والنسخ والترجمة ، والذي يتم اكتشافه بعد ذلك باستخدام مقايسة كيميائية حيوية.

مقايسة الخميرة ثنائية الهجين لتحديد الارتباط الذاتي للبروتين في خلايا الخميرة

في هذا الفيديو ، نوضح اختبار الخميرة المعدل أحادي الهجين ، والذي يكتشف بروتينات متعددة تتفاعل مع الحمض النووي المستهدف. تحتوي خلايا الخميرة المحولة على تسلسل الحمض النووي المستهدف في اتجاه المنبع لجين المراسل. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تعبر عن بروتينات عامل النسخ. عندما تشكل البروتينات مجمعات وترتبط بالحمض النووي المستهدف ، يتم التعبير عن جين المراسل ويمكن اكتشافه إنزيميا.

الاختبار الهجين المعدل للخميرة الواحدة للكشف عن تفاعلات الحمض النووي المركب للبروتين غير المتجانس

تركز هذه المقالة على تحديد مجموعات البيانات التفاعل ثقة عالية بين المضيف والممرض البروتينات باستخدام مزيج من طريقتين متعامد: الخميرة اثنين الهجين تليها مقايسة تفاعل عالية الإنتاجية في خلايا الثدييات يسمى HT-GPCA.

A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات

باستخدام ميكروأرس البروتين تحتوي على ما يقرب من S. كامل تم بحثها الخباز بروتيوم للاستجواب غير متحيز السريع الآلاف من تفاعلات البروتين البروتين بشكل متواز. هذه الطريقة يمكن استخدامها ل-بروتين صغير جزيء أو تعديل posttranslational، وفحوصات أخرى في الإنتاجية العالية.

التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات

تتفاعل البروتينات مع بعضها البعض وتحدد هذه التفاعلات في جزء كبير منها وظائفها. يمكن تحديد شركاء تفاعل البروتين بإنتاجية عالية في الجسم الحي باستخدام مقايسة لياقة الخميرة بناء على مقايسة تكميل جزء بروتين اختزال ثنائي هيدروفولات (DHFR-PCA).

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

البروتينات المستجيب البكتيرية مهمة لتأسيس العدوى الناجحة. يصف هذا البروتوكول تحديد التجريبي للشركاء ملزم البروتينية من بروتين المستجيب البكتيرية في مضيف النباتات الطبيعية لها. أصبح تحديد هذه التفاعلات المستجيب عبر الخميرة الشاشتين الهجين أداة مهمة في كشف استراتيجيات المرضية الجزيئية.

التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

الخميرة المعدلة اختبار واحد الهجين وصفها هنا هو امتداد الخميرة الكلاسيكية واحد الهجين (Y1H) فحص لدراسة والتحقق من صحة البروتين هيتيروميريك معقدة التفاعل الحمض النووي في نظام غير متجانسة لأي دراسة الجينوم وظيفية.

A الخميرة تعديل واحد نظام هجين ل هيتيروميريك البروتين مجمع دنا التفاعل الدراسات

التسلسل بالغ السكان الخميرة المختارة للتفاعلات الإيجابية الخميرة 2-الهجين يحتمل أن تكون غلة ثروة معلومات حول التفاعل شريك البروتينات. هنا، يمكننا وصف تشغيل أدوات المعلوماتية الحيوية المحددة والبرامج المحدثة المخصصة لتحليل بيانات تسلسل من هذه الشاشات.

تحليل بيانات تسلسل من دفعة الخميرة 2-الهجين شاشات المعلوماتي

تفاعلات الجزيئات الحيوية ، مثل تفاعلات البروتين والبروتين ، هي الأساس الجزيئي للوظائف البيولوجية. إذا كان من الممكن عزل طفرات التفاعل الخالية / الضعيفة التي تفتقر على وجه التحديد إلى التفاعل ذي الصلة ، فإنها ستساعد بشكل كبير على فهم وظيفة (وظائف) هذا التفاعل. تقدم هذه المقالة طريقة فعالة لعزل طفرات التفاعل الفارغة / الضعيفة.

عزل الطفرات التفاعلية الفارغة / الضعيفة باستخدام مقايسة الخميرة ثنائية الهجين

تعلم تقنية التهجين المزدوج للخميرة في المقارنة المتوازية بين تفاعلات البروتين باستخدام التسلسل العميق. تُمكّن هذه الطريقة من تحديد التفاعلات البروتينية المختلفة ودراسة وظائف الجينات في العمليات الخلوية والجزيئية.

شاشة 2-هجين خميرة في دفعة المقارنة بين تفاعلات البروتين

استكشف المزيد من الفيديوهات