العزلة والتوسع وتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية تحت الجلد وأومينتال البشرية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السمنة ، مثل تحديد العوامل والآليات الرئيسية التي تمنع الاستجابة الشحمية القوية أثناء إعادة تشكيل الأنسجة الدهنية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بعزل الخلايا البطانية CD34 + CD31 + من الأنسجة الدهنية البشرية بدءا من كميات صغيرة من الأنسجة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا تحديد الخلايا في الأوعية الدموية الدهنية البشرية التي تستجيب للتحفيز الدهني.

العرض البصري لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب ممارسة خطوات عزل الخلايا بسبب محدودية الوصول إلى الأنسجة الدهنية البشرية الطازجة في كثير من الأحيان. جمع الأنسجة الدهنية البشرية وتحت الجلد من البشر الذين يخضعون لجراحة السمنة. مباشرة بعد استخراج الأنسجة ، احتفظ بالأنسجة الدهنية البشرية وتحت الجلد في قوارير منفصلة تحتوي على محلول الملح المخزن من هانك مع 50 ميكروغراما لكل ملليلتر من البنسلين ستربتومايسين في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد وصول العينة إلى المختبر بعد استخراج الأنسجة ، قم بتنظيف وإزالة الأجزاء الليفية والمضوية من الأنسجة بعناية باستخدام مقص وملاقط 70٪ من الإيثانول. قم بوزن الأنسجة الدهنية وقسمها إلى خمسة جرامات لهضم الكولاجيناز. استخدم زوجين من المقص لفرم خمسة جرامات من الأنسجة الدهنية في خمسة ملليلتر من محلول الكولاجيناز في قارورة تلألؤ في درجة حرارة الغرفة.

أضف 10 مل إضافية من محلول الكولاجيناز إلى الأنسجة المفرومة لمدة 15 ملليلترا إجمالا. هضم العينات لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مع رج مستمر. بعد الهضم ، اسكب العينات في حقنة نهاية حادة سعة 20 مل.

قم بتصفية العينة من خلال شبكة نايلون 250 ميكرون في الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر لفصل الخلايا الشحمية وخلايا الأوعية الدموية اللحمية عن الأنسجة غير المهضومة. اغسل قارورة التلألؤ ب 10 مل من KRBBS ، واسكب الغسيل في الفلتر لجمع الخلايا المتبقية قبل احتضان العينات المفلترة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم حقنة سعة 20 مليلتر وإبرة ماصة قياس 20 × ستة بوصات لإزالة طبقة كسر الأوعية الدموية اللحمية ونقلها إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 ملليلترا.

أضف 10 مل من KRBBS واترك العينات تجلس على المقعد لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بكسور الأوعية الدموية اللحمية من كلا المستودعين على الجليد لمزيد من المعالجة. قم بتدوير كسور الأوعية الدموية اللحمية عند 500 مرة جم لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية.

قم بإزالة العينات من جهاز الطرد المركزي واسكب المادة الطافية بعناية ، مع الحفاظ على الحبيبات التي تحتوي على خلايا كسر الأوعية الدموية اللحمية. أعد تعليق كريات الخلية برفق في خمسة ملليلتر من PBS. بعد تدوير العينات مرة أخرى ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من PBS ، واحسب الخلايا.

قم بتكسير العينات للمرة الثالثة ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعزل CD34. أضف 10 ميكرولترات من كوكتيل CD34 واحتضن العينة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف خمسة ميكرولترات من الخرز المغناطيسي واحتضان العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف 2.5 مل من المخزن المؤقت لعزل CD34 إلى كل عينة ، وضع العينات في المغناطيس لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اقلب المغناطيس لمدة خمس ثوان لصب المخزن المؤقت للعزل. بعد تكرار هذه العملية أربع مرات ، قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس وأضف ملليلترين من المخزن المؤقت لعزل CD34.

بعد طرد مركزي آخر ، أعد تعليق كريات الخلايا CD34 + في مليلتر واحد من المخزن المؤقت لعزل CD34 وعد الخلايا. قم بتكسير الخلايا مرة أخرى ، وأعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من Buffer B و 250 ميكرولتر من محلول الغسيل. بعد ذلك ، أعد تعليق حبات CD31 تماما عن طريق دوامة الأنبوب ، ثم أضف 20 ميكرولترا من حبات CD31 إلى حبيبات الخلية المعاد تعليقها واحتضان العينة بالهزاز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

قبل فصل الخلية ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الغسيل لتجهيز المصفاة. ثم ضع الخليط المحضر من الخلايا المعاد تعليقها في حبات CD31 على المصفاة. اغسل المصفاة بخمسة ملليلتر من عازلة الغسيل بحركة دائرية لحجم إجمالي يبلغ 20 مل.

قم بتوصيل الموصل بأنبوب مخروطي معقم سعة 50 مليلتر وأغلق قفل اللور. بعد توصيل المصفاة بالموصل ، أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للغسيل على طول جدار المصفاة ، ثم أضف ملليلترا واحدا من Buffer D المنشط على طول جدار المصفاة. حرك العينة برفق ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الغسيل وافصل الخلايا عن الخرزات عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات. افتح قفل اللور واسمح للخلايا المنفصلة بالتدفق إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل. اغسل المصفاة 10 مرات بملليلتر واحد من محلول الغسيل في كل مرة.

تخلص من الموصل والمصفاة ، وقم بالطرد المركزي للعينات عند 300 مرة G لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أخيرا ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلترين من وسائط EGM2 الكاملة للاستزراع. قم بزراعة الخلايا في صفائح معالجة بزراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار مع وسائط EGM2 كاملة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.

استبدل الوسائط كل ثلاثة إلى أربعة أيام حتى تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من التقاء. بعد ذلك ، قم بزرع ما يقرب من 100 إلى 200 ألف خلية في ألواح من ستة آبار ، مما يضمن وجود آبار مكررة لكل مستودع ، وزرعها في وسائط EGM2 كاملة لمدة يومين. بعد يومين ، استنشق أي وسط نمو.

استبدل الوسائط بملليلترين من وسائط DMEM/F-12 بنسبة 5٪ FBS و50 ميكروغراما لكل ملليلتر من البنسلين ستربتومايسين لخلايا التحكم. بالنسبة لخلايا العلاج ، استبدل الوسائط بملليلترين من وسائط تكوين الشحم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة بنسبة 5٪ لمدة 13 يوما ، واستبدال الوسائط المعنية كل ثلاثة إلى أربعة أيام.

تظهر النتائج التمثيلية التي توضح التشكل الشبيه بالحصى البطاني النموذجي لخلايا CD34 + CD31 + بعد مقطعين في الثقافة. كما يتضح من قدرة الخلايا على تكوين الأنابيب عند زراعتها في Matrigel كما هو متوقع. يظهر الامتصاص المنتظم ل LDL الأسيتيل المسمى بالفلورسنت وجود مجموعة خلايا متجانسة ذات هوية بطانية.

يظهر هنا تلطيخ الزيت الأحمر O لقطرات الدهون المحايدة في خلايا CD34 + CD31 + بعد 13 يوما من الحث الشحمي. تظهر الاستجابات التمثيلية للخلايا من المستودعات العقلية وتحت الجلد لثلاثة أشخاص مختلفين توضح التباين الكبير في الاستجابة للحث الدهني بين مستودعات الدهون لنفس المتبرع وبين المتبرعين. تعرض هذه الصورة تلطيخ الدهون الفلورية داخل الخلايا في خلايا CD34 + C31 + بعد الحث الشحمي لمدة 13 يوما.

تظهر الصورة خلايا ذات دهون أحادية الموضع ، ودهون متعددة النواضع ، ولا يوجد تراكم للدهون. يظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي تعبير علامة الخلايا الشحمية ، وعلامة الأديبونكتين ، وعلامات البيج البني CIDEA و UCP-1. تؤكد هذه النتائج أن الخلايا التي تتبع الحث الشحمي تعبر عن علامات جزيئية تتفق مع النمط الظاهري للخلايا الشحمية البيج الأبيض المختلط.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام الأنسجة الدهنية البشرية الطازجة التي تم جمعها ولم يتم تخزينها لمدة تزيد عن ساعتين. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي ، والكيمياء المناعية ، و RT-PCR لتحديد مجموعات فرعية محددة من الخلايا المستجيبة ، والتعبير عن علامات الخلايا الشحمية الناضجة التي يمكن استخدامها لتحديد النمط الظاهري للخلايا الشحمية ذات اللون البيج البني.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال السمنة لاستكشاف أدوار الأنسجة الدهنية وخلايا الأوعية الدموية وتكوين الشحم لدى البشر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل خلايا CD34 + 31 + واستزراعها وتوسيعها. لا تنس أن العمل مع الأنسجة البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل لوائح السلامة الحيوية ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الأمراض المصاحبة المرتبطة بالسمنة ، مثل مقاومة الأنسولين ، لأنها تحدد الاستجابة الشحمية للخلايا للتدخل العلاجي المحتمل.