قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

يمكن أن يساعد هذا البحث في الإجابة على أي أسئلة في عدد الكيمياء الحيوية ومجال المنهجية مثل تحليل حقوق التنمية في الديدان الخيطية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي هطول البروتين في التدريج والمشروبات وتجانس الديدان. ابدأ هذه التجربة من خلال زراعة سلالة E.coli OP50 في 300 ملليلتر من مرق مرق LB السائل المتوسط عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

تخزين OP50 ناجحة في أربع درجات مئوية. الماصات مليلتر اثنين من OP50 مثقف على الحد الأدنى ثلاثة NGM أعدت سابقا، أو نعمة نمو وسائل الإعلام لوحات أغار وتنتشر باليد يحوم لوحة. احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها لخلق طبقة رقيقة من OP50.

بعد ذلك ، استخدم مسواك معقمة لاختيار قطعة من أجار من لوحة مع الديدان ، لإضافة ما لا يقل عن 100 ديدان لكل لوحة OP50 NGM. زراعة ما لا يقل عن ثلاثة لوحات مع الديدان في 20 درجة مئوية، حتى الديدان تصل إلى مرحلة الكبار، وهو ما يؤكد تحت المجهر مجسمة. تحديد موقع hermaphrodites غرافيد مليئة البيض باستخدام المجهر مجسمة.

بعد إضافة خمسة ملليلتر من S-العازلة إلى لوحات، واستخدام ماصة باستور لنقل الديدان من جميع لوحات ثلاثة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. اغسل الديدان ثلاث مرات عن طريق إضافة 15 ملليلتر من S-buffer ثم الطرد المركزي عند 300 مرة G في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. إذا تجاوز حجم المخزن المؤقت S-خمسة ملليلتر، إزالة المخزن المؤقت الزائد بعد الطرد المركزي.

للحصول على إستباء ناجحة وعزلة البيض السائبة، قم بحل الديدان في 0.5 ملليلتر من محلول الكلورات القلوية. اخلطي عن طريق العاكس وينكضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي في 1، 400 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لإزالة الحل.

استخدام 15 ملليلتر من S-العازلة لغسل بيليه البيض. بعد الطرد المركزي فإنه إزالة ناطور وتكرار هذا الغسيل ثلاث مرات على الأقل. بعد الغسيل الأخير، نعلق بيليه في خمسة إلى ستة ملليلتر من S-العازلة، دون E.coli واحتضان البيض بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية لتفقيس لهم وتحقيق ثقافة متزامنة H من يرقات المرحلة L1.

الماصات 10 ميكرولترات من S-العازلة التي تحتوي على الديدان L1 على ثلاث زلات الغطاء. عد اليرقات تحت المجهر المجسم وحساب المتوسط لتحديد العدد التقريبي لليرقات المرحلة L1. وأخيراً، نقل يرقات المرحلة L1 إلى خمس لوحات NGM Agar مع OP50 وتنميتها عند 20 درجة مئوية حتى مرحلة الشباب البالغين، والتي يحدث خلالها الإخصاب الذاتي ويتم وضع عدد قليل من البيض.

مراقبة الديدان كل يوم تحت المجهر ومن ثم جمع الشباب الكبار، أو الديدان القديمة خمسة أيام. لتحديد الديدان الحية فقط، أضف الديدان المعلقة في ثلاثة إلى أربعة ملليلترات من S-العازلة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. ثم إضافة حجم متساو من الجليد الباردة 60٪ السكروز ومزيج.

جهاز طرد مركزي الأنبوب في 1، 500 مرة G في أربع درجات مئوية لمدة 15 ثانية. ثم استخدم ماصة باستور لتحريك الديدان بعناية من جدار الأنبوب ، ثم قم بإزالة الديدان العائمة إلى أنبوب جديد. ملء أنبوب مع S-العازلة لغسل الديدان، والطرد المركزي في 1500 مرات G في أربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية.

إزالة المخزن المؤقت وتكرار غسل مرتين أكثر. بعد الغسيل الثالث، قم بإزالة المابير المُتقلب بعناية، مع التأكد من عدم إزالة أي ديدان، واستخدم طرف ماصة 1000 ميكرولتر لقياس الحجم الرطب للدود المغسول. بالنسبة لهطول البروتين، استخدم ماصة باستور لإضافة الديدان المغسولة إلى حجم متساوٍ من حمض ثلاثي كلوريد الأوسيتيك البارد 10٪، في التجانس الموضوع على الجليد.

التجانس باستخدام 40 السكتة الدماغية من باسل مع دوران، ما يصل إلى 1، 300 دورة في الدقيقة. استخدام التجانس بالموجات فوق الصوتية مع دورة 20٪ واجب ل sonicate التجانس. استخدام ماصة باستور لنقل متجانسة إلى 1.5 ملليلتر أنبوب وضعت على الجليد.

بعد نقل المتجانس إلى أنبوب أجهزة طرد مركزي صغيرة، الطرد المركزي في 8،000 الوقت G في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لتوضيح ذلك. نقل المابير إلى أنبوب جديد وإضافة أربعة كلوريد البوتاسيوم المولر واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة لتحييده. ثم الطرد المركزي في 8،000 مرات G في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

نقل المابير إلى أنبوب جديد وتخزينها في 80 درجة مئوية حتى الحاجة لمزيد من الأقوال. لقياس تركيز اللاكتات، استخدم مجموعة من المعايرة بالألوان لإجراء تحاليل مكررة لعينات الاختبار. إضافة 10 ميكرولترات من عينات الاختبار إلى كل بئر من لوحة 96-well، ثم إضافة مخزن فحص اللاكتات إلى كل عينة لضبط وحدة التخزين إلى 15 ميكرولترات.

تخفيف 100 ملليمولار L + لاكتات القياسية مع العازلة المقايسة اللاكتات إلى ملليمتر واحد. ثم، في سلسلة من الآبار، إضافة صفر، اثنين، أربعة، ستة، ثمانية، و 10 ميكرولترات من L + لاكتات القياسية المخففة. إضافة 50 ميكرولترات من مزيج رد فعل إلى كل بئر، واحتضان في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء لمدة 30 دقيقة على الأقل للون لتطوير.

وأخيراً، استخدم قارئ الصهقرة الدقيقة لقياس امتصاص كل بئر عند 570 نانومتر. طرح امتصاص مزيج التحكم في الخلفية من امتصاص مزيج التفاعل. ثم رسم منحنى اللاكتات القياسي، وحساب تركيزات اللاكتات من المنحنى بضرب كل تركيز في 2.25.

استخدم مجموعة من المعايرة الملونة لقياس تركيز البيروفات في عينات الاختبار، وإجراء فحوصات دوبليكس. إضافة 10 ميكرولترات من عينات الاختبار إلى آبار مختلفة من لوحة 96 جيدا، وإضافة 90 ميكرولترات من كاشف العمل إلى كل عينة. احتضان تغطي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم ضع اللوحة في قارئ الصهقرة الصغيرة لقياس امتصاص كل بئر في 570 نانومتر. رسم منحنى البيروفات القياسي، وحساب تركيزات البيروفات من المنحنى القياسي بضرب كل تركيز في 2.25. وأخيرا، لقياس تركيز البروتين في عينات الاختبار، واستخدام مجموعة من المعايرة colorimetric كما هو موضح في بروتوكول النص.

بعد هطول البروتين، يمكن استخدام المقايسات colorimetrics لتحديد كمي من تركيزات اللاكتات و بيروفات. هذه التجربة تظهر دقة المعايرات colorimetric على عكس التقارير السابقة في C.Elegans. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المقاييس حساسة بما فيه الكفاية لقياس تركيزات اللاكتات والبيروفات حتى في العينات الصغيرة في فترة زمنية قصيرة.

للكشف بدقة عن اللاكتات والبيروفات في C.elegans ، من المهم إجراء هطول البروتين أثناء تجانس الديدان. كمية اللاكتات و pyruvate الكشف عن أعلى عندما عينات هي البروتين عجلت أثناء التجانس، مقارنة مع الكسر السيتوسولي السليمة أو بعد التجانس عندما لم يكن هناك لاكتات أو بيروفات الكشف على الإطلاق.