أوزة إيمبروفيسوس بالانوس "نموذج البحرية"-استزراع و "التعبير الجيني"

أوزة إيمبروفيسوس بالانوس (أمفيبالانوس) نموذج لدراسة أوسموريجوليشن والمضادة للحشف على السفن. بيد التفريخ الموسمية الطبيعية غلة عرض لا يمكن التنبؤ بها لليرقات سيبريد. هنا، هو وصف بروتوكول لاستزراع كل سنة-الجولة من إيمبروفيسوس باء ، بما في ذلك إنتاج اليرقات. ويتضح استخدام الإوز المستزرعة في دراسات التعبير الجيني.

يمكن أن يساعد مرفق الاستزراع في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيئة اليرقات ، والقاشف الحيوي ، والبيولوجيا التطورية. وبشكل أكثر تحديدا ، يمكن استخدامه في الدراسات التي أجريت على تفاعلات المستقبلات والترابط أثناء استقرار اليرقات ، وتطوير تقنيات جديدة مضادة للحشف ، وتطور ووظيفة الجينات المشاركة في تنظيم التناضح. الميزة الرئيسية لهذا الكائن الحي النموذجي هي أن البرنقيل Balanus improvisus قوي ، يتكاثر على مدار السنة ، وله وقت جيل قصير نسبيا.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لزراعة البرنقيل ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على زراعة الكائنات البحرية الأخرى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب العدد الكبير من التفاصيل المهمة للنجاح ، مثل توفير مياه البحر الجيدة ، والإنتاج القوي للأعلاف عالية الجودة ، والحضور المستمر لتنظيف وتغذية الثقافات. سيوضح الإجراء مارتن أوجيمارك وآنا ليزا رانج ، الفني والباحث الذي يعمل مع البرنقيل.

للبدء ، قم بإعداد إطارات يمكنها استيعاب العديد من الألواح البلاستيكية الحرارية الشفافة. قم بحفر فتحتين في الزوايا العلوية لكل لوحة واستخدم روابط الكابلات لربط الألواح بالإطارات. لجمع البرنقيل البالغ ، انشر الألواح عموديا على عمق متر إلى ثلاثة أمتار في المياه الهادئة.

بعد السماح للبرنقيل بالاستقرار والنمو إلى خمسة ملليمترات في القطر ، أحضر الألواح إلى المختبر. ثم ضع الألواح عموديا في حامل به أخاديد مطحونة في صينية بولي إيثيلين. أولا ، باستخدام شريط غير سام ومقاوم للماء ، قم بلصق خمس ألواح معا لإنشاء مكعب مفتوح في الأعلى.

ضع المكعب في صينية صغيرة واملأه بمياه البحر. بعد ذلك ، أضف ما يقرب من 200 سيبريد في الجزء العلوي من المكعب. كل يومين ، قم بإطعام البرنقيل اليافع ب 100 مل من الهيكل العظمي مارينوي.

بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع ، يجب أن تحتوي ألواح المكعب على أحداث ثابتة لا يقل قطرها عن خمسة ملليمترات. قم بتفكيك المكعب ، وانقل الألواح إلى صواني بها مياه البحر المتدفقة. لحصاد نوبلي الأرتيميا ، قم أولا بإيقاف تشغيل مضخة التهوية وتغميق الزجاجة ، ثم قم بإضاءة الجزء السفلي من الزجاجة لمدة 10 دقائق.

سوف يسبح نوبلي أرتيميا المفرغ نحو الضوء. سوف تغرق الأكياس غير المفرغة في القاع ، بينما تطفو قذائف الكيس إلى الأعلى. افتح المشبك في الأسفل واجمع الجزء الوسيط كعدد كثيف من نوبلي أرتيميا السباحة.

لتنظيف الألواح باستخدام البرنقيل البالغ ، قم برشها برفق بالماء العذب وإزالة أي قاذورات بفرشاة أسنان ناعمة. نظف الصواني بدون البرنقيل والأنابيب بالماء العذب الساخن. بعد ذلك ، ضع غربالا في صينية البولي إيثيلين بمنفذ فائض.

اجمع يرقات البرنقيل التي تستقر في المنخل طوال الليل. ثم املأ دلوا ب 20 لترا من مياه البحر المفلترة ولتر واحد من خليط الطحالب الدقيقة الثنائي لخلق كثافة 50،000 دياتومات لكل مليلتر. انقل نوبلي البرنقيل الذي تم جمعه مسبقا إلى طبق متبلور وقم بإضاءة الطبق من الجانب.

ثم استخدم ماصة لجمع النوبلي الذي يسبح نحو الضوء ونقلها إلى طبق آخر. انقل النابلي إلى دورق يحتوي على لتر واحد من مياه البحر المفلترة للعد. بعد ذلك ، أضف لترا واحدا من النابلي إلى الدلو المعد مسبقا.

بعد ثلاثة أيام ، استخدم منخل 90 ميكرومتر لجمع نوبلي البرنقيل ، ثم قم بتنظيف الدلو ، واملأه بمياه البحر المفلترة ، وأضف علفا جديدا للدياتومات ونوبلي البرنقيل. بعد يومين إلى ثلاثة أيام أخرى من الحضانة ، استخدم منخل 320 ميكرومتر فوق غربال 160 ميكرومتر لفصل نوبلي البرنقيل غير المنصهر عن cyprids. بعد إعداد أربع زجاجات سعة أربعة لترات لزراعة الطحالب الدقيقة ، ضع الزجاجات في الضوء بكثافة 50 إلى 100 ميكرومول لكل متر مربع.

احصد الثقافات عندما تكون كثيفة بما يكفي لاستخدامها في التغذية. أولا ، حدد أفرادا كبيرا وامنع الطعام لمدة يومين قبل التشريح. بعد ذلك ، قم بتنظيف قشرة البرنقيل بفرشاة أسنان واشطفها بالماء لتقليل التلوث من الأنواع الأخرى الموجودة في البيئة.

ضع برنقيل فردي على سطح مستو للتشريح ، ثم أدخل طرف زوج من الملقط بين صفائح tergal و scutal. أمسك بلوحة واحدة واسحبها برفق لإزالتها. بعد ذلك ، استخدم الملقط للإمساك بالسيري وسحب البرنقيل للخارج مباشرة.

أخيرا ، ضع البرنقيل المقطوع مباشرة في 96٪ من الإيثانول أو محلول تثبيت الحمض النووي الريبي للتثبيت. باستخدام البروتوكول الموضح هنا ، يمكن إنتاج ما يصل إلى أربع دفعات من يرقات البرنقيل في أسبوع واحد. كحد أقصى ، تتكون كل دفعة من نظام الاستزراع من حوالي 12،000 نوبلي ، مما يعني أنه يمكن استزراع ما يصل إلى 50،000 نوبلي في الأسبوع.

في غضون أسبوع ، سيتطور 70 إلى 90٪ من النابلي الذي تم جمعه إلى cyprids ، مما ينتج عنه ما يقرب من 30،000 cyprids في الأسبوع. تم الحصول على ما معدله 500 نانوجرام من الحمض النووي الريبي عالي الجودة من ما لا يقل عن 20 سيبريد فردي بغض النظر عن مرحلة الاستقرار. في البرنقيل ، يتحلل 28S rRNA عند تسخينه.

يوفر التجانس بواسطة الخرز الخزفي للحمض النووي الريبي أعلى درجات السلامة ، مما يجعله الطريقة المفضلة للتعامل مع أنسجة البرنقيل والمفصليات. باستخدام تحليل qPCR ، لوحظت زيادة مضاعفة للمتغيرات الطويلة من NAK1 mRNA والملوحة المنخفضة مقارنة ب NAK القصير. يشير هذا إلى أن الشكل الطويل هو السائد في ظل ظروف الملوحة المنخفضة.

مطلوب بضعة أسابيع من التدريب لإتقان الخطوات المختلفة التي تنطوي عليها ثقافة البرنقيل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم بشكل خاص تقليل التلوث في جميع خطوات سير عمل الزراعة. بعد تطويرها ، كانت تقنية الاستزراع هذه مفيدة في إعطائنا فهما أفضل لبيئة البرنقيل وعلم وظائف الأعضاء والبيولوجيا الجزيئية.

كما أنه حجر زاوية مهم في تحويل البرنقيل Balanus improvisus إلى نظام نموذج بحري قوي.