بيوبرينتابل الجينات/الجيلاتين المائية 3D في المختبر النموذجي النظم الحث على تشكيل خلية كروي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا السرطان ، مثل تكوين الورم ، وتتبع هجرة الخلايا ، وإشارات السرطان والخلايا السليمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بدراسة تكوين الأورام في بيئة ثلاثية الأبعاد جنبا إلى جنب مع الخلايا اللحمية ، مثل الخلايا الليفية ، بتكلفة منخفضة وقابلية عالية للتكاثر. من المهم التأكد من أن المواد قابلة للطباعة الحيوية ووظيفية حيوية ، الأمر الذي يتطلب دراسة كمية لخصائصها الانسيابية وتوافق الخلايا.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات تحضير الهيدروجيل وخلط الهيدروجيل الخلوي لأن تكوين الفقاعات يتداخل مع دقة النموذج المطبوع. في خزانة السلامة الحيوية ، اخلطي ثلاثة جرامات من الألجينات وسبعة جرامات من مسحوق الجيلاتين في دورق سعة 250 مل. أضف أداة تقليب مغناطيسية و 100 مل من DPBS.

أغلق الدورق بغشاء بارافين معقم ورقائق الألومنيوم لتجنب التلوث. ثم أظهر للمشارك المخططات القطبية الفريدة والمحددة التي تتوافق مع أنماط تخطيط كهربية العضل ، أو مخطط كهربية العضل. بعد ذلك ، استمر في التحريض في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

سخني المحلول عند 37 درجة مئوية حتى يخضع الجل لمرحلة انتقالية إلى الحالة السائلة. ثم انقل المحلول إلى أنابيب طرد مركزي مخروطية معقمة سعة 50 مليلتر ، وأغلقها. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 834 مرة جم لمدة خمس دقائق للتخلص من أي فقاعات غاز.

بعد ذلك ، قم بشفط سلائف الهيدروجيل في محاقن سعة 10 ملليلتر. أغلق المحاقن بأغطية وغشاء البارافين. يحفظ على حرارة أربع درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

عندما تكون جاهزا لبدء الاختبار ، ضع حقنة من سلائف الهيدروجيل المحضرة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أثناء ارتفاع درجة حرارة المحقنة ، قم بتشغيل وتكوين مقياس الريومتر. بعد ساعة ، أخرج المحقنة من الحمام المائي.

بثق ما يقرب من 0.5 مل من السلائف على منصة مقياس الريومتر. في لوحة التحكم ، انقر فوق زر المثلث الهابط. انتظر حتى تنتقل أداة القياس إلى وضع التشذيب.

باستخدام ملعقة ، قم بقص أي سلائف زائدة هربت من حافة أداة القياس ، وتخلص من المواد الزائدة عن الحاجة. ثم ماصة الزيت المعدني على حافة أداة القياس. انتظر حتى يغلق الزيت الحدود بالكامل.

في لوحة التحكم، انقر فوق متابعة. ثم انقر فوق الزر "ابدأ". بعد اكتمال الاختبار ، حرر أداة القياس ، وانقر فوق زر المثلث الصاعد.

قم بإزالة أداة القياس. قم بتنظيف كل من أداة القياس والمنصة بنسبة 70٪ من الإيثانول. أولا ، اكتمل السعة ودرجة الحرارة كما هو موضح في بروتوكول النص.

لبدء مسح الوقت متساوي الحرارة، انقر فوق تطبيقاتي، وانقر فوق القالب الخاص باختبار درجة حرارة الوقت متساوي الحرارة. انقر فوق خطوة القياس في سير العمل. ثم انقر فوق إجهاد التذبذب المتغير ، واسحب نافذة الإعداد لأعلى.

اضبط سلالة التذبذب على 0.1٪ واضبط تردد التذبذب على هرتز واحد. في نافذة السحب ، اضبط عدد نقاط البيانات على 120. اضبط تكرار جمع البيانات على نقطة واحدة في الدقيقة.

انقر فوق الزر "إضافة" لإضافة متغير درجة الحرارة. انقر فوق درجة الحرارة المتغيرة ، واضبطها على 25 درجة مئوية. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الخطوة الجهاز، الانتقال إلى نقطة القياس في سير العمل.

انقر على حذف. ثم انقر فوق الخطوة الجهاز، تعيين القيمة. قم بإلغاء تحديد المربع انتظر حتى يتم الوصول إلى القيمة ، واضبط القيمة على 25 درجة مئوية.

انقر فوق صورة ، عنوان ، أزرار في الشاشة السفلية. قم بإلغاء تحديد المربع متابعة. ثم انقر فوق الخطوة ابدأ ، قم بتسمية المشروع ، واحفظه.

الآن قم بتحميل العينة على منصة مقياس الريومتر ، وابدأ الاختبار باتباع بروتوكول الاختبار العام الموصوف سابقا. بعد ذلك ، لاحظ G prime و G العدد الأولي المزدوج مقابل الوقت. أوجد نقطة التقاطع ل G العدد الأولي المزدوج G والعدد الأولي G ، وحدد الوقت عند نقطة التقاطع.

ثم انقر فوق جدول، وانسخ جميع البيانات، والصقه في ملف نصي. لقياس قوة الإنتاجية في أوقات التبلور المختلفة، انقر فوق تطبيقاتي. انقر فوق قالب إجهاد العائد والتدفق، مثل الهلام.

قم بتسمية هذا المشروع. بعد ذلك ، انقر فوق خطوة البدء في سير العمل. في القائمة العلوية، انقر على إدراج.

ثم في القائمة المنسدلة، حدد انتظر. اسحب نافذة الإعداد لأعلى ، واضبط وقت الانتظار على 50 دقيقة. انقر على ابدأ، ثم انقر على إدراج مرة أخرى.

حدد الجهاز من القائمة المنسدلة. اسحب نافذة الإعداد لأعلى ، وحدد درجة الحرارة ، واضبطها على 25 درجة مئوية. قم بإلغاء تحديد المربع انتظر حتى يتم الوصول إلى القيمة.

في سير العمل، حدد خطوة القياس. حدد متغير إجهاد القص ، واسحب نافذة الإعداد لأعلى. اضبط إجهاد القص الأولي والنهائي على صفر و 10 ، 000 باسكال ، على التوالي.

ثم انقر فوق الآلة الحاسبة ، اضبط كثافة النقطة على 0.2 نقطة لكل باسكال. في علامة التبويب نقاط البيانات على اليسار، قم بتعيين نقطة واحدة في الثانية. في الجزء السفلي من نافذة السحب، حدد علامة التبويب التحكم في الأحداث، وقم بتعيين المعيار إيقاف القياس إذا كان معدل القص أكبر من 100 في الثانية.

قم بتحميل العينة على منصة مقياس الريومتر ، وابدأ الاختبار باتباع بروتوكول الاختبار العام الموصوف سابقا. بعد اكتمال الاختبار ، انقر فوق رسم تخطيطي لمراقبة منحنى الإجهاد والإجهاد. كرر هذا الاختبار لأوقات الانتظار 30 و 40 و 50 دقيقة.

يجب تنفيذ الخطوات التالية في ظروف معقمة. للبدء ، قم بتعقيم الطابعة الحيوية عن طريق رشها جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم تعريضها للأشعة فوق البنفسجية طوال الليل. قم بإزالة حقنة من سلائف الهيدروجيل من التخزين ، وقم بتسخينها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

انقل قارورة T من الخلايا المستزرعة مسبقا من حاضنة CO2 إلى خزانة السلامة الحيوية. تخلص من وسط المزرعة ، ثم اشطف الخلايا مرتين باستخدام DPBS. أضف محلول التربسين EDTA الدافئ إلى الخلايا.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ست دقائق. بعد ذلك ، قم بإلغاء تنشيط التربسين عن طريق إضافة نفس حجم FBS. قم بإزالة حقنة سلائف الهيدروجيل من الحمام المائي ونظفها.

عقم المحقنة بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل نقلها إلى خزانة السلامة الحيوية. قم بثق ما يقرب من ثلاثة ملليلتر من سلائف الهيدروجيل في خرطوشة طباعة سعة 10 ملليلتر. امزج السلائف مع خلايا MDA-MB-231-GFP بتركيز مليون خلية لكل مليلتر عن طريق ماصتها ببطء لتجنب إنتاج الفقاعات.

قم بتغطية الخرطوشة بنهاية وأغطية علوية ، وأغلقها بغشاء البارافين. ثم قم بطرده المركزي عند 834 مرة جم لمدة دقيقة واحدة للتخلص من أي فقاعات غاز. كرر هذه العملية برمتها للسلائف الأخرى.

بعد ذلك ، قم بتعقيم جميع الخراطيش الثلاث بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بتحميل الخراطيش المعقمة في غرف الطابعة الحيوية. في برنامج التحكم في الطابعة، انقر فوق يدوي.

ثم قم بتوسيع علامة التبويب رأس الأداة في برنامج التحكم في الطابعة. انقر فوق خرطوشة واحدة في واجهة الرسومات على الجانب الأيسر ، واضبط درجة حرارة الخرطوشة على 25 درجة مئوية ، وانتظر 35 دقيقة للسماح للسلائف بالوصول إلى الظروف القابلة للطباعة. كرر هذا مع الخرطوشتين الأخريين.

في برنامج التحكم في الطابعة، قم بتوسيع علامة التبويب رأس الأداة. انقر فوق خرطوشة واحدة في واجهة الرسومات، ثم انقر فوق الزر القياس القصير لقياس موضع طرف الفوهة. كرر هذا مع الخرطوشتين الأخريين.

بعد ذلك ، ضع صفيحة دقيقة شفافة من البوليسترين على مرحلة الطابعة. افتح ملف G-code ، وقم بتغيير الضغط إلى 200 كيلو باسكال لجميع الخراطيش. ارجع إلى برنامج التحكم ، وانقر فوق علامة التبويب Scaffolder Generator.

حدد نقطة لبدء الطباعة، ثم انقر فوق الزر تشغيل. كرر هذه العملية للحصول على ثلاث نسخ مكررة. بعد ذلك ، أضف محلول كلوريد الكالسيوم 100 مللي مولار لمدة دقيقة واحدة لربط النماذج.

اشطفه مرتين باستخدام DPBS. ثم استخدم ملعقة لنقل النماذج بعناية إلى طبق مطلي بستة آبار ومغلفة بالأغروز. أضف خمسة ملليلتر من DMEM إلى كل بئر ، واحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لتحل محل وسط زراعة الخلايا كل ثلاثة أيام.

في هذه الدراسة ، يتم تصنيع أنظمة هيدروجيل ثلاثية الأبعاد لتلخيص البيئات الدقيقة للورم في الجسم الحي وتسهيل تكوين كرويات الورم متعددة الخلايا. يظهر مسح درجة حرارة السلائف A3G7 أن G أولي مزدوج أكبر من G أولي عند 37 درجة مئوية ، مما يثبت صحة الخصائص المعروفة للسلائف. مع انخفاض درجة الحرارة ، تخضع السلائف للتبلور الفيزيائي بسبب التشابك المادي التلقائي لجزيئات الجيلاتين في تكوين ثلاثي الحلزون.

يزيد كل من G prime و G المزدوج من انخفاض درجة الحرارة والتقارب عند 30.6 درجة مئوية ، مما يشير إلى انتقال sol-gel. يظهر الفحص المجهري متحد البؤر لنموذج المروحة المطبوع أن خلايا MDA-MB-231-GFP تبدأ في تطوير الكرويات بعد 15 يوما من فترة الثقافة ، وتستمر الكرات في الزيادة في الحجم والأعداد حتى اليوم 30. ينظر أيضا إلى بعض خلايا IMR-90-mCherry على أنها تشكل تكتلات.

بعد 30 يوما من الثقافة ، يمكن ملاحظة خلايا IMR-90-mCherry في المنطقة التي احتلتها في البداية خلايا MDA-MB-231-GFP ، بينما يمكن رؤية خلايا MDA-MB-231-GFP في المنطقة التي تهيمن عليها IMR-90-mCherry. هذا يعني أحداث الترحيل المحتملة في النموذج. يكشف الفحص المجهري متحد البؤر لنموذج القرص أن خلايا MDA-MB-231-GFP تتصرف بشكل مشابه لما كانت عليه في نموذج المروحة ، مما ينتج عنه هيدروجيل محمل بالكروية بعد 21 يوما من الزراعة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية لطباعة النماذج في غضون ساعتين ، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على الهيدروجيل والخلايا طازجة قدر الإمكان ، وعدم خلط دفعات الهيدروجيل القديمة مع دفعات جديدة ، والعمل في ظل ظروف معقمة لتجنب النتائج المضللة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل مسح الإلكترون والفحص المجهري بفاصل زمني من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل مسامية المواد ومعدل هجرة الخلايا وإعادة تشكيل المصفوفة.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى علاج السرطان لأن هذا النموذج في المختبر يسمح بإجراء دراسات خاضعة للرقابة بشكل منهجي لتكوين الورم وسلوكه في أنظمة الزراعة المشتركة. إلى جانب خلايا سرطان الثدي ، يمكن أيضا تطبيق النموذج بسهولة على الأنظمة التي تستخدم أنواعا أخرى من الخلايا في مواقع أولية مختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نماذج أمراض غير متجانسة ثلاثية الأبعاد عن طريق إعداد الهلاميات المائية بشكل صحيح ، وتضمين الخلايا في المواد وطباعتها داخل نافذة الطباعة المثلى.

لا تنس أن العمل مع العينات البيولوجية يمكن أن يكون خطيرا للغاية والاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية ، مثل القفازات ومعطف المختبر ونظارات السلامة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.