استخدام البروتينات النووية الذاتية من الخلايا المزروعة تحت ظروف التاكسج بالانزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال نقص الأكسجين ، مثل التفاعلات الداخلية والأصلية بين عوامل النسخ ومنظمات النسخ الخاصة بها في ظل ظروف نقص الأكسجة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا الناقصة للأكسجين يتم حصادها في ظل ظروف نقص الأكسجين وتستخدم الكسور النووية في الترسيب المناعي المشترك. يستخدم هذا البروتوكول خلايا الكلى الجنينية البشرية 293A المزروعة في أربعة أطباق بحجم 10 سم.

البذور ثلاثة إلى خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل طبق في 10 ملليلتر من وسط النسر المعدل من Dulbeco مع 10٪ FBS و L-glutamine وبيروفات الصوديوم والبنسلين والستربتومايسين. استزراع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد أربع وعشرين ساعة من البذر ، عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من التقاء ، ضع طبقين في الغرفة الفرعية لنقص الأكسجة في صندوق قفازات الحاضنة مع 1٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

احتفظ بالطبقين الآخرين في نورموكسيا. في اليوم السابق لحصاد الخلايا المعالجة بنقص الأكسجة ، قم بموازنة DPBS مسبقا لظروف نقص الأكسجة عن طريق وضع زجاجة كاشف زجاجي تجريبية مكشوفة سعة 100 مل مملوءة ب DPBS في الغرفة الفرعية لنقص الأكسجة لمدة 24 ساعة. قبل حوالي ساعة واحدة من حصاد الخلايا ، ضع صندوقا ثلجيا يحتوي على ثلج في غرفة معالجة صندوق القفازات ، والتي تم موازنة 1٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

انقل الزجاجة التي تحتوي على DPBS ناقصة التأكسج الموازنة مسبقا من الغرفة الفرعية لنقص الأكسجة إلى غرفة المعالجة وضعها على الجليد. بعد أربع ساعات من علاج نقص الأكسجة ، انقل الخلايا من الغرفة الفرعية لنقص الأكسجة إلى غرفة المعالجة التي تم موازنتها مسبقا مع 1٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإزالة وسط الاستزراع عن طريق الشفط وباستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر ، اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 ملليلتر من DPBS

باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر ، أضف 5 ملليلتر من DPBS المتوازن مسبقا المثلج وقم بإزاحة الخلايا عن طريق الكشط باستخدام مكشطة الخلية. قم بإمالة لوحة زراعة الخلية ، واجمع الخلايا المنفصلة باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. احتفظ بأنبوب الخلايا على الجليد.

افتح الباب بين غرف المعالجة والعازلة في صندوق القفازات ، وكلاهما تم موازنته مسبقا مع 1٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. انقل الأنابيب المخروطية سعة 15 مليلتر على الجليد التي تحتوي على خلايا معالجة بنقص الأكسجة من غرفة المعالجة إلى الغرفة العازلة. افتح باب الغرفة العازلة وقم بإزالة الخلايا تماما من صندوق القفازات.

بيليه كل من الخلايا الناقصة للأكسجين والخلايا النورموكسيكية عن طريق الطرد المركزي عند 1000 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. سيتم استخدام مجموعة أدوات استخراج نووي لهذا الإجراء. ابدأ بإعادة تعليق كل حبيبات خلية برفق في 500 ميكرولتر من محلول التحلل NL ، مع استكمال كوكتيل مثبط البروتياز 1X في 0.1 مولار DTT عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات.

أضف 25 ميكرولترا من محلول المنظفات NP إلى تعليق الخلية والدوامة لمدة 10 ثوان بأقصى سرعة. جهاز طرد مركزي عند 1000 مرة 10 جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. احفظ كل من المادة الطافية والحبيبات النووية.

بعد جمع المادة الطافية وتخزينها كما هو موضح في بروتوكول النص ، أعد تعليق نوى الخلايا المحتوية على الحبيبات في 500 ميكرولتر من محلول التحلل NL ، مع استكمال كوكتيل مثبط البروتياز 1X و 0.1 مولار DTT عن طريق الدوامة لمدة خمس ثوان بأقصى سرعة. أعد تعليق الحبيبات النووية في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج NX1 ، مكملا بكوكتيل مثبط البروتياز 1X عن طريق سحب الحبيبات لأعلى ولأسفل عدة مرات. احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة.

كل خمس دقائق ، دوامة لمدة 10 ثوان بأقصى سرعة. جهاز طرد مركزي عند 12،000 × جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. اجمع المادة الطافية وانقلها إلى أجهزة غسيل الكلى المصغرة بحجم أقصى 100 ميكرولتر لكل وحدة لتحلية المياه.

قم بتغطية أجهزة غسيل الكلى المصغرة وضعها في جهاز التعويم. ضع جهاز التعويم في دورق يحتوي على 500 مل من محلول غسيل الكلى المبرد مسبقا. احرص على تجنب ملامسة الجلد مباشرة أو استنشاق عازلة غسيل الكلى ، لأنها تحتوي على PMSF.

احتضن على أربع درجات مئوية مع التحريك اللطيف لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، اجمع العينات من زاوية أجهزة غسيل الكلى المصغرة وانقلها إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 12 ألف مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

Aliquot 25 ميكرولترا من كل طافية في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ميكرولتر وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. تحضير حبات البروتين AG sepharose لاستخدامها في المناعة. ماصة 50 ميكرولتر من الخرز في كل من أربعة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مليلتر وإضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت DPBS لكل أنبوب.

بيليه الخرز بالطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TBS. أضف ميكرولترين من الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل ARNT أو الغلوبولين المناعي للفأر G الذي تم تحضيره عن طريق إعادة تكوين 0.7 ملليغرام من IgG للفأر في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت TBS.

خذ أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على الخرز إلى غرفة باردة. ضعها في أنبوب دوار واحتضانها عند 10 دورات في الدقيقة لمدة ساعتين. بعد ساعتين ، قم بتكسير الخرزات عن طريق الطرد المركزي وتخلص من المواد الطافية.

خفف 200 ميكروغرام من محللة البروتين النووي المحضرة مسبقا في 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت للترسيب المناعي. احتضان المحللة بالخرز المقترن بالأجسام المضادة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بحبيبات الخرز بالطرد المركزي عند 3000 مرة جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية.

تخلص من المادة الطافية. أضف ملليلترا واحدا من TBS المثلج الذي يحتوي على 0.2٪ NP-40 إلى كل أنبوب وقم بتدويره. بهذه الطريقة ، اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام TBS المثلج الذي يحتوي على 0.2٪ NP-40.

اغلي الخرزات في 50 ميكرولترا من عينة Laemmli على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. الطرد المركزي الخرز عند 10 آلاف مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. اجمع المادة الطافية وتخلص من الخرز.

تم فحص مستويات التعبير في التوطين تحت الخلوي لمكونات مركب HIF-1 بعد علاج نقص الأكسجة في HEK293A الخلايا. كما هو متوقع ، تم تنظيم مستويات HIF-1a الإجمالية بسبب نقص الأكسجة بينما لم يتم تغيير مستويات ARNT في المحللات الخلوية الإجمالية بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، تسبب نقص الأكسجة في التراكم النووي لكل من HIF-1a و ARNT.

تم إجراء تجارب الترسيب المناعي المشترك باستخدام مستخلصات نووية من خلايا HEK293A تعرضت لظروف طبيعية أو نقص الأكسجة. كما هو موضح هنا ، تم ترسيب HIF-1a مع ARNT من المستخلصات النووية لخلايا HEK293A ناقصة التأكسج ، مما يشير إلى أن HIF-1a يتفاعل مع ARNT في ظل ظروف نقص الأكسجة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال نقص الأكسجة لاستكشاف تفاعلات بروتين البروتين النووي الذاتية وظروفها الناقصة للأكسجين.