تحديد التقسيم غشاء البلازما للبروتينات المرتبطة محيطيا

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الخلية ، بما في ذلك كشف مسارات إشارات الخلية. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها في الواقع لا تتطلب أي مناهج مجهرية متطورة. كما أنه سريع جدا وبالتالي يمكن استخدامه للمراقبة في الوقت الفعلي لتوزيع البروتين في الخلايا.

يعد تقييم وقياس التقسيم الغشائي للبروتين المرتبط محيطيا أمرا معقدا بسبب حيود الضوء الذي يتسبب في اختلاط غشاء البلازما والتألق السيتوبلازمي تحت المجهر. ابدأ هذا الإجراء بإعداد المواد البيولوجية كما هو موضح في بروتوكول النص. تلطيخ المادة المحضرة بصبغة FM 4-64 عن طريق تطبيق بروتوكول تلطيخ مناسب للمادة المدروسة.

بالنسبة لخلايا التبغ BY-2 ، قم بتلطيخ 200 ميكرولتر من معلق الخلية مع 0.2 ميكرولتر من محلول FM 4-64 10 ملليمولار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد. لالتقاط قسم متحد البؤر الاستوائي واحد لكل خلية واحدة ، قم بتعيين مسح متسلسل ثنائي القناة للكروموفور المستخدم كعلامة بروتين و FM 4-64. قم أيضا بتعيين دقة بصرية أعلى.

مثال على الإعداد هو هدف الغمر بالزيت 63 مرة بفتحة رقمية تبلغ 1.3 وحجم صورة 1,024 × 1,024 بكسل. قم بتثبيت Fiji ImageJ Distribution وجهاز الماكرو الطرفي المطلوب. في فيجي ، حدد المكونات الإضافية ، ثم وحدات الماكرو ، ثم قم بالتثبيت في القائمة الرئيسية وحدد المسار إلى الملف الذي تم تنزيله باستخدام جهاز الماكرو ImageJ الطرفي.

قم بتثبيت برنامج R Project والحزم المطلوبة. قم بتشغيل واجهة المستخدم الرسومية R ، وحدد الحزم ، ثم قم بتثبيت الحزم في القائمة الرئيسية ، وحدد أقرب مستودع بالإضافة إلى الحزمة ggplot2 للتثبيت. قم بتنزيل الجهاز الطرفي R Package.

قم بتثبيتها عن طريق تحديد الحزم ثم تثبيت الحزم من الملفات المحلية. معالجة الصور متحد البؤر للعلامة السيتوبلازمية. للقيام بذلك ، قم باستيراد الصور إلى فيجي باستخدام المكونات الإضافية ثم التنسيقات الحيوية ، ثم مستورد التنسيقات الحيوية من قائمة فيجي مع الإعدادات الافتراضية.

قم بتشغيل ماكرو خيارات الاستيراد لإعداد التحليل. قم بتنشيط الماكرو عن طريق تحديد نفس العنصر بعد النقر فوق قائمة البروتين المحيطي لأداة القائمة. حدد القيمة المناسبة في الحقل غوسيان ضبابية نصف قطر بكسل.

هذا يؤثر على تنعيم الصورة وتقليل الضوضاء. القيمة المنخفضة كافية ولا تسبب أي فقدان لمعلومات الصورة. الآن قم بتعيين قيمة في بكسل عرض خط ملف تعريف الحقل.

يؤدي الخط السميك إلى تنعيم أعلى لمنحنيات الملف الشخصي. يوصى بقيمة افتراضية تبلغ 10 بكسل. قم بتعيين عنوان صورة، مع التحليل حسب تعريف محددات العينة والعناصر المصدرة.

انقر فوق موافق. تحقق من تحليل العنوان في نافذة الحوار التالية وانقر فوق موافق أو رجع لإعادة التعيين. بعد ذلك ، قم بإجراء اختيار خطي عبر منطقة غشاء البلازما في الصور المعالجة وقياس ملفات تعريف التألق. للقيام بذلك ، حدد الخط المستقيم لأداة فيجي من شريط أدوات فيجي.

انقر فوق الصورة واسحب خطا عبر منطقة غشاء البلازما. يجب أن يبدأ الخط في الفضاء خارج الخلية ويجب أن يكون عموديا على غشاء البلازما. اختر المناطق ذات الطبقة السميكة والأكثر تجانسا من السيتوبلازم القشري.

الطول الأمثل للاختيار الخطي هو خمسة إلى 10 ميكرون. قم بتشغيل ماكرو أخذ ملف التعريف بالنقر فوق أداة أخذ ملف تعريف في شريط أدوات فيجي. سيتم إجراء القياس التلقائي لملامح التألق في كلتا القناتين ، وسيتم عرض البيانات في نافذة النتائج.

وفقا لتباين الإشارة الفردية ، خذ أرقاما تمثيلية للملفات الشخصية لكل خلية. قم بتشغيل ماكرو بيانات ملف تعريف المخطط للتصور الرسومي لملفات التعريف المقاسة. قم بتعيين المعلمة في نافذة حوار الماكرو التي تم استدعاؤها.

احتفظ بخانة الاختيار استخدام التصفية لبيانات الإدخال غير محددة. حدد ما إذا كان يجب إنشاء المخطط من البيانات الحديثة في نافذة النتائج من ملف CSV واحد أو من جميع ملفات CSV في دليل محدد بالنقر فوق زر الاختيار المناسب. حدد عوامل التجميع التي سيتم استخدامها للتخطيط عن طريق تحديد خانات الاختيار المناسبة.

حدد العامل I إذا كان يجب عرض جميع ملفات التعريف في مخططات فريدة. احتفظ بخانات الاختيار غير المحددة إذا كان يجب رسم كافة البيانات في مخطط واحد. انقر فوق موافق. حدد المسار واسم الملف لحفظ النتائج أو لاستيراد البيانات النهائية في نافذة الحوار التالية.

قم بتأكيد التحليل بالنقر فوق موافق في نوافذ الحوار، لإظهار التعليمات البرمجية R التي تم إجراؤها. قم بتشغيل ماكرو إعداد تصفية ملف التعريف إذا كانت بعض ملفات التعريف المرسومة تحتوي على إشارات زائدة في الفضاء خارج الخلية أو داخل الخلايا. اتبع عن طريق تعيين المعلمات في نافذة حوار الماكرو التي تم استدعاؤها.

لكل قناة ، قم بتعيين عتبة الشدة المناسبة في الملف ، وقم بإزالة القياسات بإشارة مفرطة خارج الخلية أو داخل الخلية. حدد المنطقة التي سيتم فيها تطبيق حد الشدة في الحقل عند إحداثيات X أقل أو أكبر من، ثم انقر فوق موافق. قم بتشغيل ماكرو بيانات ملف تعريف المؤامرة مرة أخرى مع تحديد خانة الاختيار استخدام التصفية لإدخال البيانات. أضف الآن البيانات من الملف المحفوظ مسبقا.

تأكد من إزالة جميع ملفات التعريف الشاذة بنجاح، وإلا فقم بتحسين معلمات التصفية. قم بتشغيل ماكرو نموذج الإنشاء لإنشاء نموذج لغشاء البلازما وتوزيع مضان السيتوبلازم بناء على بيانات المعايرة. بعد تعيين المعلمات في نافذة حوار الماكرو التي تم استدعاؤها كما هو مفصل في بروتوكول النص، انقر فوق موافق. حدد مسار ملف الإدخال واسمه في نوافذ الحوار التالية وقم بتأكيد التحليل بالنقر فوق موافق في نافذة الحوار التي تعرض التعليمات البرمجية R التي تم إجراؤها.

بعد ذلك ، قم بمعالجة صور الخلايا التي تعبر عن البروتين محل الاهتمام. قم باستيراد الصور وإعداد التحليل كما كان من قبل. يجب أن يكون التنعيم وعرض الخط متطابقين.

تابع لقياس الملفات الشخصية. تحقق من دقة ملفات التعريف عن طريق التخطيط ، وقم بتعيين التصفية إذا رغبت في ذلك كما هو موضح سابقا. قم بتشغيل حساب التوزيع الكلي لحساب تقسيم البروتين بين غشاء البلازما وفي السيتوبلازم.

حدد بيانات الإدخال ومصادر النموذج وقم في النهاية بتعيين تصفية البيانات. احتفظ بخانة الاختيار نشطة لإزالة النتائج ذات التباين المتبقي أكبر مما لو كانت تصفية النتائج مطلوبة. حدد عتبة الحد الأقصى المسموح به للتغير المتبقي الذي يمكن أن يفسر بتحلل إشارة قياس المظهر الجانبي الفردي.

حدد نماذج عوامل التجميع، والتي يمكن استخدامها لإنشاء مخطط مربع. انقر فوق موافق، وحدد مسارات الإدخال أو الإخراج، وقم بتأكيد التحليل بالنقر فوق موافق في نافذة الحوار التي تعرض كود R الذي تم إجراؤه. تظهر هنا صورة لخلية ملطخة FM 4-64 تعبر عن بروتين نباتي ، والذي يرتبط بغشاء البلازما عبر N-myristoylation والتفاعل الكهروستاتيكي مع الفوسفينوسيتيدات.

تم إزعاج هذه التفاعلات تجريبيا بواسطة wortmannin. تم اختبار أهمية N-myristoylation عن طريق طفرة في الجلايسين في موضع الأحماض الأمينية الثاني الذي يعمل كموقع N-myristoylation. تم اختبار تأثير إزالة كل من قدرات ربط غشاء البلازما عن طريق اقتطاع المجال الطرفي N للبروتين.

يظهر مخطط الصندوق الناتج انخفاضا في تقارب غشاء البلازما بعد طفرة موقع N-myristoylation وبعد العلاج بالعقاقير. تأثيرها المتبادل مشابه لتأثير إزالة المجال الطرفي N. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ الخطوات الرئيسية للتحليل بترتيب مناسب وكيفية تعيين معاييرها.

بعد هذا التحليل ، يمكن إجراء طريقة إحصائية مثل ANOVA للتقييم الإحصائي للبيانات التي تم الحصول عليها. على الرغم من أن هذه الطريقة تم تطويرها لخلايا المعلقة النباتية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الخلايا أو الأنسجة الأخرى ذات أغشية البلازما الملساء والقابلة للتمييز بوضوح.