Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Fr&#233;d&#233;ric Knoflach; Maria-Clemencia Hernandez; Daniel Bertrand

doi:10.3791/57842

اكتب أساليب لاكتشاف مركبات الرواية تحوير مستقبلات حمض غاما أمينوبوتيريك – كبيرة

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

اكتب أساليب لاكتشاف مركبات الرواية تحوير مستقبلات حمض غاما أمينوبوتيريك – كبيرة

Full Text

14,323 Views

07:16 min

August 16, 2018

DOI: 10.3791/57842-v

Frédéric Knoflach¹, Maria-Clemencia Hernandez¹, Daniel Bertrand²

¹Discovery Neuroscience, Pharma Research and Early Development,Roche Innovation Center Basel, ²HiQScreen Sàrl 6

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents protocols for the discovery of compounds that interact with GABA A receptors, utilizing a screening cascade that combines radioligand binding and electrophysiological techniques. The approach aims to identify selective and efficacious compounds through iterative testing in Xenopus oocytes and rodent brain slices.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Pharmacology
Electrophysiology

Background

Understanding GABA A receptors' activity is crucial for pharmacological applications.
Compounds interacting with these receptors can have therapeutic effects on neurological disorders.
Electrophysiological recordings provide insights into the physiological impact of these compounds.
Iterative screening enhances compound profile optimization.

Purpose of Study

To develop a systematic approach for discovering novel ligands for GABA A receptors.
To enhance the capabilities of binding assays and electrophysiological analyses.
To facilitate the identification of compounds with potential clinical significance.

Methods Used

The research employs ex vivo brain slice preparations and Xenopus oocytes for compound testing.
Electrophysiological recordings are performed to measure responses in brain slices and oocytes, assessing the activity of ligands.
The study outlines specific timelines for procedures such as oocyte maintenance and compound perfusion.
Detailed injection techniques for plasmid delivery into oocytes and recording setups for slice preparations are described.

Main Results

The study outlines successful identification of compounds that selectively modulate GABA A receptor activity.
Electrophysiological recordings demonstrated changes in population spike amplitudes in response to ligand application.
Insights were gained regarding the mechanistic roles of GABA A receptor inhibition and compound dosage effects.
Validation of results through robust statistical methods to establish reliability in findings.

Conclusions

This study enables the identification of selective GABA A receptor ligands with potential therapeutic uses.
It highlights the importance of combining binding assays with physiological recordings for compound evaluation.
The findings contribute to a better understanding of ligand-receptor interactions and their implications for drug development.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of the screening cascade used in this study?

The screening cascade integrates multiple experimental approaches, allowing for a comprehensive evaluation of ligand efficacy and selectivity at GABA A receptors.

How is the biological model of Xenopus oocytes implemented?

Xenopus oocytes are injected with plasmids to express GABA A receptors, which are then used to test the activity of different compounds through electrophysiological recordings.

What types of data are obtained from electrophysiological recordings?

Electrophysiological recordings provide data on population spike amplitudes and the effects of specific ligands on neuronal excitability.

How can this method be applied in drug development?

This method can be adapted to screen a wide range of compounds for their effects on GABA A receptors, aiding in the identification of potential therapeutics for CNS disorders.

What key considerations should be made when interpreting results?

Considerations include the stabilizing effects of compounds on receptor activity and the need for robust statistical validation of findings to ensure reproducibility.

نقدم هنا، بروتوكولات لاكتشاف المركبات النشطة في مستقبلات GABA_A ، من الربط لعلم وظائف الأعضاء وعلم الصيدلة.

الهدف العام من هذا الفيديو هو توضيح سلسلة الفحص التي تسمح باكتشاف روابط مستقبلات GABA-A الجديدة. تتمثل ميزة استخدام ربط الربط الإشعاعي والتسجيل الفيزيولوجي الكهربي في بويضات xenopus وفي شرائح دماغ القوارض بطريقة حرفية في أنه يمكن تحسين ملف تعريف المركب. في النهاية ، يتم تحديد النوع الفرعي القوي والمركبات الانتقائية والفعالة.

سيتم تنفيذ هذا العرض من قبل Kumico Kambara و Jenna Tognaccini بالإضافة إلى سونيا ودانيال برتراند من HiQScreen و Marie Claire Pflimlin من Roche. حقن 10 إلى 50 نانولتر من المحلول المحتوي على البلازميد باستخدام إبرة حقن زجاجية بقطر طرف يصل إلى 100 ميكرومتر مركب على معالج دقيق مزود بنظام طرد الضغط أو بنظام حقن آلي. لبدء هذا الإجراء ، احتفظ بالبويضات عند 17 درجة مئوية لمنع التعبير عن بروتينات الصدمة الحرارية.

قم بتخزين الصفيحة الدقيقة في منطقة تخزين يتم التحكم فيها حراريا. بعد ذلك ، قم بإذابة مركبات الاختبار ، التي تم اختبارها إيجابية في اختبار الربط في OR2 ، عند 0.1 و 1000 ميكرومولار للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية والتخلص منها في صفيحة بولي بروبيلين مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا. لإجراء تسجيل مشبك جهد قطب كهربائي ، ضع لوحة تحتوي على البويضات على النظام الآلي.

قم ببرمجة نظام التسجيل الآلي باستخدام الواجهة المستندة إلى الأيقونة مع هذا المخطط لتحديد علاقة نشاط التركيز بشكل مناسب. لتركيب المنحنى ، باستخدام منحنى تنشيط التركيز المصور ، ارسم السعة الحالية كدالة للوغاريتم تركيز ناهض. للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي ، احتفظ بالدماغ في محلول dACSF المليء بالكربوجين في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بتشريح تكوين الحصين الأيسر بملعقة دقيقة. بعد ذلك ، قم بتقسيم الشرائح المستعرضة بسماكة 400 ميكرومتر من الجزء المتوسط من الحصين باستخدام مروحية الأنسجة. باستخدام فرشاة الطلاء ، انقل الشرائح إلى غرفة التسجيل واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بدمج الشرائح باستخدام rACSF مع الكربوجين عند 35 درجة مئوية وبمعدل 1.5 مل في الدقيقة. لتسجيل ارتفاع فردي في عدد السكان ، ضع شريحة دماغية في الغرفة المثبتة على المجهر. قم بتدمير الشريحة باستخدام rACSF بمعدل ثلاثة ملليلتر في الدقيقة.

باستخدام مجتذب الماصة، اسحب ماصة زجاجية من البورسليكات بمقاومة تبلغ حوالي ميغا أوم. املأ الماصة الدقيقة بمحلول يحتوي على اثنين من كلوريد الصوديوم المولي وضعها في حامل الماصة. ضع الماصة الدقيقة المسجلة في الطبقة الهرمية في منطقة CA1 من شريحة الحصين باستخدام المعالج الدقيق الصحيح.

بعد ذلك ، ضع قطب كهربائي ثنائي القطب من البلاتين المعزول في الحامل الموجود على المعالج الدقيق الأيسر. ضع قطب التحفيز في ضمانات شافر في منطقة CA1 من شريحة الحصين باستخدام المعالج الدقيق الأيسر. باستخدام مولد التحفيز ، قم بتوصيل نبضة حالية إلى قطب التحفيز كل 30 ثانية وقم بزيادة قوة التحفيز تدريجيا حتى يظهر ارتفاع في عدد السكان.

اضبط قوة التحفيز لاستحضار ارتفاع عدد السكان المقابل 45٪ من الحد الأقصى للسعة التي يمكن الحصول عليها. لإجراء تثبيط النبض المزدوج ، قم بتوصيل نبضتين حاليتين إلى قطب التحفيز كل 30 ثانية باستخدام مولد التحفيز. اضبط قوة التحفيز لاستحضار ارتفاع عدد السكان المقابل 45٪ من السعة القصوى.

لاختبار المركبات ، قم بعمل تخفيفات للمركبات المراد اختبارها في ACSF بحيث لا يزيد التركيز النهائي ل DMSO عن 0.1٪ أضف DMSO إلى محلول التحكم بنفس تركيز الموجود في المحلول المركب. سجل ارتفاعا واحدا أو مزدوجا في عدد النبضات الناجمة عن التحفيز الجانبي لشافر كل 30 ثانية لمدة 30 دقيقة على الأقل. يجب أن يكون شكل الارتفاع السكاني مستقرا خلال فترة خط الأساس هذه.

بعد ذلك ، قم بإعداد دورق من rACSF المكربن يحتوي على تركيز ثابت من المركب المراد اختباره وزرع شريحة الحصين بالمحلول أثناء تسجيل طفرات النبض المفردة أو المزدوجة. أيضا ، قم بتقييم التعافي من التأثير المركب عن طريق حشو الشريحة باستخدام rACSF المكربن بدون المركب. يظهر هنا تمثيل تخطيطي لشريحة الحصين الفئران ، وضمانات شافر التي تنشأ من محاور الخلايا الهرمية CA3 التي تسقط على الشجرة الشجيرية للخلايا العصبية الهرمية CA1.

تم وضع الماصات الدقيقة في الطبقة الهرمية لتسجيل الارتفاعات السكانية وفي الطبقة رادياتوما للتسجيلات الشجيرية لإمكانات ما بعد المشبك المثيرة للحقل. تم وضع قطب التحفيز داخل ضمانات شافر. يوضح هذا الشكل طفرات سكانية ناتجة عن المحفزات المزدوجة المطبقة من خلال نفس القطب المحفز بفاصل زمني يبلغ 20 مللي ثانية.

الاستجابة السكانية للحافز الثاني ذات سعة أصغر من استجابة الحافز الأول. تم تسجيل طفرات في عدد السكان في غياب ووجود بيتا CCM ، وهو مستقبل GABA A غير انتقائي NAM. عزز Beta CCM سعة الارتفاع السكاني الثاني عن طريق منع أي تثبيط جبارجي للتغذية الأمامية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى كما هو الحال في الحركية الدوائية وشغل المستقبلات وفعاليتها في الجسم الحي وعلم الأدوية الآمن من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل إمكانية التطوير السريري للمركبات المحددة.

Explore More Videos

علم الأعصاب والمسألة 138 علم الأدوية المخدرات كبيرة المثبطة مستقبلات GABAA اكتشاف وفحوصات ملزمة والكهربية إعداد التسجيل الآلي