اكتب أساليب لاكتشاف مركبات الرواية تحوير مستقبلات حمض غاما أمينوبوتيريك – كبيرة

الهدف العام من هذا الفيديو هو توضيح سلسلة الفحص التي تسمح باكتشاف روابط مستقبلات GABA-A الجديدة. تتمثل ميزة استخدام ربط الربط الإشعاعي والتسجيل الفيزيولوجي الكهربي في بويضات xenopus وفي شرائح دماغ القوارض بطريقة حرفية في أنه يمكن تحسين ملف تعريف المركب. في النهاية ، يتم تحديد النوع الفرعي القوي والمركبات الانتقائية والفعالة.

سيتم تنفيذ هذا العرض من قبل Kumico Kambara و Jenna Tognaccini بالإضافة إلى سونيا ودانيال برتراند من HiQScreen و Marie Claire Pflimlin من Roche. حقن 10 إلى 50 نانولتر من المحلول المحتوي على البلازميد باستخدام إبرة حقن زجاجية بقطر طرف يصل إلى 100 ميكرومتر مركب على معالج دقيق مزود بنظام طرد الضغط أو بنظام حقن آلي. لبدء هذا الإجراء ، احتفظ بالبويضات عند 17 درجة مئوية لمنع التعبير عن بروتينات الصدمة الحرارية.

قم بتخزين الصفيحة الدقيقة في منطقة تخزين يتم التحكم فيها حراريا. بعد ذلك ، قم بإذابة مركبات الاختبار ، التي تم اختبارها إيجابية في اختبار الربط في OR2 ، عند 0.1 و 1000 ميكرومولار للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية والتخلص منها في صفيحة بولي بروبيلين مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا. لإجراء تسجيل مشبك جهد قطب كهربائي ، ضع لوحة تحتوي على البويضات على النظام الآلي.

قم ببرمجة نظام التسجيل الآلي باستخدام الواجهة المستندة إلى الأيقونة مع هذا المخطط لتحديد علاقة نشاط التركيز بشكل مناسب. لتركيب المنحنى ، باستخدام منحنى تنشيط التركيز المصور ، ارسم السعة الحالية كدالة للوغاريتم تركيز ناهض. للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي ، احتفظ بالدماغ في محلول dACSF المليء بالكربوجين في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بتشريح تكوين الحصين الأيسر بملعقة دقيقة. بعد ذلك ، قم بتقسيم الشرائح المستعرضة بسماكة 400 ميكرومتر من الجزء المتوسط من الحصين باستخدام مروحية الأنسجة. باستخدام فرشاة الطلاء ، انقل الشرائح إلى غرفة التسجيل واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بدمج الشرائح باستخدام rACSF مع الكربوجين عند 35 درجة مئوية وبمعدل 1.5 مل في الدقيقة. لتسجيل ارتفاع فردي في عدد السكان ، ضع شريحة دماغية في الغرفة المثبتة على المجهر. قم بتدمير الشريحة باستخدام rACSF بمعدل ثلاثة ملليلتر في الدقيقة.

باستخدام مجتذب الماصة، اسحب ماصة زجاجية من البورسليكات بمقاومة تبلغ حوالي ميغا أوم. املأ الماصة الدقيقة بمحلول يحتوي على اثنين من كلوريد الصوديوم المولي وضعها في حامل الماصة. ضع الماصة الدقيقة المسجلة في الطبقة الهرمية في منطقة CA1 من شريحة الحصين باستخدام المعالج الدقيق الصحيح.

بعد ذلك ، ضع قطب كهربائي ثنائي القطب من البلاتين المعزول في الحامل الموجود على المعالج الدقيق الأيسر. ضع قطب التحفيز في ضمانات شافر في منطقة CA1 من شريحة الحصين باستخدام المعالج الدقيق الأيسر. باستخدام مولد التحفيز ، قم بتوصيل نبضة حالية إلى قطب التحفيز كل 30 ثانية وقم بزيادة قوة التحفيز تدريجيا حتى يظهر ارتفاع في عدد السكان.

اضبط قوة التحفيز لاستحضار ارتفاع عدد السكان المقابل 45٪ من الحد الأقصى للسعة التي يمكن الحصول عليها. لإجراء تثبيط النبض المزدوج ، قم بتوصيل نبضتين حاليتين إلى قطب التحفيز كل 30 ثانية باستخدام مولد التحفيز. اضبط قوة التحفيز لاستحضار ارتفاع عدد السكان المقابل 45٪ من السعة القصوى.

لاختبار المركبات ، قم بعمل تخفيفات للمركبات المراد اختبارها في ACSF بحيث لا يزيد التركيز النهائي ل DMSO عن 0.1٪ أضف DMSO إلى محلول التحكم بنفس تركيز الموجود في المحلول المركب. سجل ارتفاعا واحدا أو مزدوجا في عدد النبضات الناجمة عن التحفيز الجانبي لشافر كل 30 ثانية لمدة 30 دقيقة على الأقل. يجب أن يكون شكل الارتفاع السكاني مستقرا خلال فترة خط الأساس هذه.

بعد ذلك ، قم بإعداد دورق من rACSF المكربن يحتوي على تركيز ثابت من المركب المراد اختباره وزرع شريحة الحصين بالمحلول أثناء تسجيل طفرات النبض المفردة أو المزدوجة. أيضا ، قم بتقييم التعافي من التأثير المركب عن طريق حشو الشريحة باستخدام rACSF المكربن بدون المركب. يظهر هنا تمثيل تخطيطي لشريحة الحصين الفئران ، وضمانات شافر التي تنشأ من محاور الخلايا الهرمية CA3 التي تسقط على الشجرة الشجيرية للخلايا العصبية الهرمية CA1.

تم وضع الماصات الدقيقة في الطبقة الهرمية لتسجيل الارتفاعات السكانية وفي الطبقة رادياتوما للتسجيلات الشجيرية لإمكانات ما بعد المشبك المثيرة للحقل. تم وضع قطب التحفيز داخل ضمانات شافر. يوضح هذا الشكل طفرات سكانية ناتجة عن المحفزات المزدوجة المطبقة من خلال نفس القطب المحفز بفاصل زمني يبلغ 20 مللي ثانية.

الاستجابة السكانية للحافز الثاني ذات سعة أصغر من استجابة الحافز الأول. تم تسجيل طفرات في عدد السكان في غياب ووجود بيتا CCM ، وهو مستقبل GABA A غير انتقائي NAM. عزز Beta CCM سعة الارتفاع السكاني الثاني عن طريق منع أي تثبيط جبارجي للتغذية الأمامية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى كما هو الحال في الحركية الدوائية وشغل المستقبلات وفعاليتها في الجسم الحي وعلم الأدوية الآمن من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل إمكانية التطوير السريري للمركبات المحددة.