وصف الاستجابات ايستب الغلوبولين المناعي تعتمد على الغدة الصعترية، والغدة الصعترية مستقلة في الفئران باستخدام مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم
سبتمبر 7, 2018
في هذه الورقة، ويصف لنا بروتوكولا لوصف استجابات ايستب الغلوبولين المناعي (Ig) T-تعتمد على والمستقلة تي في الفئران باستخدام ELISA. تستخدم هذه الطريقة وحدها أو في تركيبة مع التدفق الخلوي سوف تسمح الباحثين تحديد الفروق في الاستجابات ايستب بالخليه بوساطة Ig في الفئران بعد التحصين مستضد تعتمد على T ومستقلة عن تي.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة حول استجابات الأجسام المضادة المستحثة عن التحصين المستضد المعتمدة والمستقلة بالإضافة إلى تنشيط الخلايا البائية وتفاعلات المركز الجرثومي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر قياسات موثوقة وكمية لاستجابة النمط الإسوائفي Ig مع مقارنة مباشرة لتنشيط الخلايا البائية والمناعة الخلطية في الفئران. للتحصين ضد TNP-polysaccharide ، قم بتحميل حقنة أنسولين ملليلتر واحدة لكل فأر مع 100 ميكرولتر من محلول المستضد المحضر حديثا وأدخل الإبرة في الربع الأيمن السفلي من كل بزاوية 30 درجة تقريبا لتجنب حقن العضو السفلي.
عندما يتم حقن جميع الفئران ، أعد إلى أقفاصها للسكن في منشأة محددة خالية من مسببات الأمراض. في النقاط الزمنية التجريبية المناسبة ، تجمع 150 إلى 200 ميكرولتر من الدم من كل محصن عن طريق النزيف المداري الرجعي والسماح للعينات بالتخثر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ساعتين. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي لعينات الدم المتخثرة ونقل المصل الشفاف من أعلى كل جلطة دموية إلى أنبوب معقم من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر.
بعد الطرد المركزي الثاني لإزالة أي جلطة دموية متبقية ، قم بنقل 50 ميكرولترا من المصل إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة فردية سعة 1.5 مليلتر لتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. قبل الطلاء ، قم بتغطية 96 صفيحة مناعية جيدة للأفراد بتركيز مناسب من الأجسام المضادة الخاصة بالنمط المتنظير Ig للفأر لمستضد النمط المتماثل Ig الكلي TNP-38BSA لنمط Ig الخاص ب TNP أو مستضد TNP-3BSA للحصول على نمط Ig الخاص ب TNP عالي التقارب واحتضان الألواح المطلية طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، اغسل الأطباق مرتين ب 200 ميكرولتر من محلول الغسيل لكل بئر.
تخلص من مخزن الغسيل والتربيت على الأطباق حتى تجف على كومة من المناشف الورقية بعد كل غسلة. بعد ذلك ، قم بسد الألواح ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لكل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أثناء حظر الألواح ، قم بإعداد التخفيفات القياسية والمصل المناسبة ومانع المخزن المؤقت في صفيحة منفصلة غير معالجة 96 بئر عند 150 ميكرولتر لكل بئر كما هو موضح.
ثم اغسل لوحة ELISA بمحلول غسيل كما هو موضح وأضف 100 ميكرولتر من كل معيار Ig متماثل مخفف وعينة مصل إلى الآبار المناسبة للوحة ELISA. بعد حضانة ليلية عند أربع درجات مئوية ، اغسل الألواح كما هو موضح وأضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المناسب للنمط المتقارن بالفوسفاتيز القلوي المخفف في مانع المخزن المؤقت لكل بئر لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اغسل الأطباق وأضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة المحضر حديثا إلى كل بئر.
مراقبة التفاعل أثناء تطوره خلال الدقائق القليلة القادمة في درجة حرارة الغرفة. عندما يكون التفاعل قويا بما يكفي للتحليل ، ضع اللوحة في قارئ صفيحة دقيقة وانقر فوق الإعدادات لضبط الطول الموجي على 405 نانومتر. انقر فوق موافق ثم انقر فوق القالب لتعيين الآبار الفارغة والقياسية وغير المعروفة المناسبة وفقا لإعداد لوحة البئر 96.
ثم عندما يصل المعيار الأكثر تركيزا إلى كثافة بصرية تبلغ حوالي واحد و 1.5 و اثنين و 2.5 ، انقر فوق القراءة لقراءة اللوحة وحفظ ملف البيانات الناتج بعد كل تحليل. في حالة عدم وجود تحصين ، لوحظت زيادة في مستويات المصل القاعدي ل IgM و IgG2a و IgG2b و IgG3 و IgA في العامل الثالث المرتبط بمستقبلات عامل نخر الورم الخام الخاص بالخلايا البائية أو الفئران بالضربة القاضية B-TRAF3 ، مقارنة بحيوانات التحكم في رفيق القمامة B-TRAF3 المطابقة للجنس والعمر . بعد سبعة أيام من التحصين باستخدام TNP-polysaccharide أو TNP-KLH كما أظهر للتو ، يكشف تحليل استجابات النمط المتماثل Ig المستقلة عن الغدة الصعترية للتحصين عن مستويات IgG3 المستقلة عن الغدة الصعترية ، بالإضافة إلى ارتفاع مستويات IgG2b الخاصة ب TNP المعتمدة على الغدة الصعترية في الفئران بالضربة القاضية TRAF3 الخاصة بالخلايا النخاعية مقارنة بضوابط رفيقة القمامة.
علاوة على ذلك ، يشير تقييم استجابات الفئران الأولية والذاكرة المعتمدة على الغدة الصعترية للتحصين على TNP-KLH إلى وجود انخفاض جزئي في استجابات IgM الأولية المعتمدة على الغدة الصعترية واستجابات IgG1 الأولية والذاكرة المعيبة في الفئران بالضربة القاضية TRAF3 الخاصة بالخلايا التائية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن ELISA لها حدود اكتشاف يتم تحديدها عادة من خلال النطاق الخطي للمنحنيات القياسية ، وبالتالي قد تكون هناك حاجة إلى تخفيفات متعددة للعينة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق تكميلية أخرى مثل قياس التدفق الخلوي أو بقعة L لاكتساب فهم شامل لاستجابات الأجسام المضادة في بيئة تجريبية معينة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه الورقة بروتوكولاً لتوصيف استجابات النمط الجيني للأجسام المضادة (Ig) المعتمدة على الخلايا التائية وغير المعتمدة عليها في الفئران باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). وتتيح هذه الطريقة للباحثين تحديد الاختلافات في استجابات النمط الجيني لـ Ig التي تتوسطها الخلايا البائية بعد التحصين بالمستضد.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم المناعة
- الاستجابات للأجسام المضادة
- تنشيط الخلايا البائية
خلفية علمية
- يعد فهم الاستجابات المناعية للأجسام المضادة المعتمدة على الخلايا T وغير المعتمدة عليها أمراً بالغ الأهمية في علم المناعة.
- يساعد توصيف استجابات الأنماط الإيمونوغلوبولينية (Ig isotype) في دراسة المناعة الخلطية.
- يمكن أن يكمل قياس التدفق الخلوي (Flow cytometry) تحليل ELISA للحصول على تحليل مفصل.
- تعتبر القياسات الموثوقة لاستجابات الأنماط الإيمونوغلوبولينية (Ig isotype) أساسية للأبحاث العلمية.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول لقياس استجابات الأنماط الإيمونوغلوبولينية (Ig isotype) في الفئران.
- مقارنة تنشيط الخلايا البائية (B cell) استجابةً لمستضدات مختلفة.
- تعزيز فهم الاستجابات المناعية في سياقات متنوعة.
الطرق المستخدمة
- مقايسة الممتز المجهري المرتبط بالإنزيم (ELISA) لتقدير استجابات الأنماط الإيمونوغلوبولينية.
- قياس التدفق الخلوي لتحليل تنشيط الخلايا البائية.
- حقن محلول المستضد في الفئران لغرض التحصين.
- جمع عينات الدم لتحليل المصل.
النتائج الرئيسية
- تم إجراء قياسات كمية لاستجابات النمط الإسوي لـ Ig.
- لوحظت اختلافات في تنشيط الخلايا البائية بناءً على نوع المستضد.
- أثبتت الطريقة موثوقيتها في دراسة المناعة الخلطية.
- تم الحصول على عينات مصل صافية لإجراء المزيد من التحاليل.
الاستنتاجات
- يُعد هذا البروتوكول فعالاً في توصيف الاستجابات المناعية للأجسام المضادة.
- يوفر هذا البروتوكول رؤى حول المناعة التي تتوسطها الخلايا البائية.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في مختلف الدراسات المناعية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يتيح هذا البروتوكول لباحثي الأدوية الحيوية تحليل استجابات أنماط الأجسام المضادة المناعية المعتمدة على الغدة الزعترية وغير المعتمدة عليها كمياً في النماذج الفأرية، مما يوفر رؤية ميكانيكية حول تنشيط الخلايا البائية والمناعة الخلطية. ومن خلال تقديم قياسات ELISA دقيقة ومحددة للنمط المناعي، يدعم هذا البروتوكول عملية التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر التنبؤية في تطوير اللقاحات والمعدِّلات المناعية. وتعزز هذه الطريقة الاستمرارية الانتقالية عند دمجها مع فحوصات مكملة مثل قياس التدفق الخلوي، مما يساهم في اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف في مراحل الاكتشاف المبكرة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس استجابات IgM النوعية للمستضد واستجابات IgG/IgA/IgE التي حدث لها تبديل النمط الإيمونوغلوبوليني تجاه المحفزات المعتمدة على الغدة الزعترية وغير المعتمدة عليها.
- القيمة التشغيلية: توفر قياسات معيارية وقابلة للتكرار للأجسام المضادة في المصل، مما يوضح مدى الارتباط الوظيفي بالهدف والنشاط البيولوجي للمرشحات المعدلة للمناعة.
- القيمة التنبؤية: تدعم فرز محفظة المشاريع من خلال التمييز بين الفئات الميكانيكية للمستضدات بناءً على أنماط تبديل النمط الإيمونوغلوبوليني وحركية استجابة الذاكرة.
الفرز وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: توليد أنظمة بيولوجية مصادق عليها (أمصال فئران) مع مخرجات كمية لأنماط Ig المناعية المناسبة لسير عمل الفحص اللاحق.
- إمكانية التكرار: تقديم إجراءات ELISA معيارية بمتطلبات تخفيف محددة وضوابط للنطاق الخطي، مما يضمن اتساق المقايسة عبر التجارب المختلفة.
- القابلية للتوسع: دعم إعادة استخدام المنصة لإجراء تحليل مقارن لتركيبات المستضدات، أو المواد المساعدة، أو النماذج الجينية في حملات فحص الاستمناع.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: يتيح تقييم الاستجابات النوعية للمستضد في النماذج التي تعكس المناعة الخلطية البشرية، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية الانتقالية.
- الاستمرارية قبل السريرية: يربط تحديد نمط الإيزوتايب لـ Ig في مرحلة الاكتشاف المبكر بالتحقق قبل السريري من خلال أخذ عينات مصلية طولية قبل التحصين وبعده.
- قرارات معدلة حسب المخاطر: يوجه معايير التقدم من خلال تحديد العيوب في تبديل الإيزوتايب (على سبيل المثال IgG1) أو استجابات الذاكرة المرتبطة بمسارات خلوية محددة (على سبيل المثال T cell TRAF3).
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشاف المتصلة، بدءاً من التحقق الأولي من الهدف، مروراً بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى التقييم قبل السريري، خاصة بالنسبة للمعدِّلات المناعية واللقاحات حيث يتنبأ تحديد النمط الإسوي بالنتائج الوظيفية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال ربط التعرض للمستضد ببصمات محددة لأنماط IgG isotype (على سبيل المثال، TI IgG3 مقابل TD IgG2b).
- الفحص: توفر قراءات كمية جاهزة للمقايسة تتميز بخصوصية وحساسية عاليتين، مما يتيح مقارنة موثوقة للإمكانات المناعية عبر المرشحين المختلفين.
- التحليلات: تقدم قياسات قائمة على الكثافة الضوئية عند 405 nm يتم استنتاجها من منحنيات قياسية، مما يسمح بإجراء مقارنة إحصائية بين المجموعات لعيارات الأجسام المضادة.
- الأبحاث الانتقالية: تتوافق مع الاستمرارية قبل السريرية من خلال تمكين التتبع الطولي للاستجابات الأولية والذاكرة، وهو أمر بالغ الأهمية لتقييم اللقاحات المرشحة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس أداة توصيف مناعي قابلة لإعادة الاستخدام وتطبق عبر مشاريع متعددة تتضمن الاستجابات التي تتوسطها الخلايا B.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في مسارات تنشيط الخلايا البائية B cell.
- القيمة التشغيلية: تضمن التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال بروتوكولات محددة لتخفيف المصل وخطوات تحسين مقايسة ELISA.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن عملية اتخاذ القرار بشأن المتابعة أو التوقف عبر ربط ملفات النمط الإسوي (isotype) بالنتائج المناعية الوظيفية، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد أولويات المرشحين بناءً على تعديل المخاطر وقدرتهم على استحثاث استجابات الذاكرة وتبديل النمط الإسوي المطلوبة.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في علم المناعة الفأرية، والتعامل مع المصل، وتحسين مقايسة ELISA لضمان التقدير الكمي الدقيق ضمن النطاق الخطي لمنحنيات القياس
- تعتمد على توفر أجهزة قراءة الأطباق الدقيقة، والحاضنات، وأجهزة الطرد المركزي، ومرافق زراعة الأنسجة المعقمة لمعالجة المصل وتنفيذ المقايسة
- تستلزم توحيد المعايير بين الفرق فيما يتعلق بتوقيت جمع العينات، وتقنيات سحب الدم (مثل السحب من خلف المحجر)، وظروف التخزين (−80 °C) للحفاظ على سلامة البيانات
- تتطلب مراعاة اعتبارات التكيف عند التوسع في استخدام سلالات فأرية مختلفة، أو مستضدات مختلفة (مثل TNP-KLH مقابل TNP-polysaccharide)، أو أنظمة مواد مساعدة مختلفة (alum مقابل PBS)
- قيد عملي: غالبًا ما يكون التخفيف التسلسلي للعينات ضروريًا لتجنب تشبع الإشارة وضمان الاستيفاء الدقيق من منحنيات القياس، مما يزيد من وقت العمل اليدوي
الأسئلة الشائعة حول الصناعات الدوائية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
2,4,6-Trinitrophenyl (TNP)-polysaccharide and TNP-keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Immunization and Serum Preparation
1:54
Enzyme-linked Immunosorbent Analysis (ELISA)
4:17
Results: Representative Thymus-independent (TI) and Thymus-dependent (TD) Ig Isotype responses to TNP-polysaccharide and TNP-KLH Immunization
5:36
Conclusion
