والرزن سريع فوعة جرثومية المستندة إلى الصور استخدام أميبا

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التسبب في المرض البكتيري ، مثل متى يتم التعبير عن مؤثرات الفوعة القاتلة للمضيف في الخلايا البكتيرية ، وما هي حالات الفوعة للخلايا المزروعة المرتبطة بالسطح؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة وكمية ويسهل التعامل مع الخلايا المضيفة نسبيا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا أن السكان الفرعيين المزروعين المرتبطين بالسطح من Pseudomonas لديهم أنماط ظاهرية مختلفة لقتل المضيف.

للبدء في نمو سلالة الإشريكية القولونية BR بين عشية وضحاها كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم أحضر ثقافة الإشريكية القولونية إلى درجة حرارة الغرفة. باستخدام عصا خشبية ، قم بتلميع الأميبا في 750 لترا من الثقافة.

أضف على الفور 700 لتر من خليط الإشريكية القولونية الأميبا إلى طبق GYP. قم بإمالة اللوحة لنشر الثقافة بالتساوي على سطح اللوحة. ثم ضع الطبق في صندوق يحافظ على رطوبة عالية.

احتضن اللوحة داخل الصندوق عند 22 درجة مئوية لمدة أربعة إلى خمسة أيام. بعد انتهاء فترة الحضانة ، استخدم طرف ماصة معقمة لجمع جراثيم الأميبا من نصف اللوحة. ثم قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الأميبا على طرف الماصة في 1 مل من وسط PS.

انقل خليط التلقيح إلى قارورة سعة 250 مل مع 25 مل من وسط PS مكمل بمحلول مضاد للميكروبات الحيوية. ازرع الأميبا عند 22 درجة مئوية في شاكر دوار عند 100 دورة في الدقيقة. بعد زراعة Pseudomonas aeruginosa بين عشية وضحاها ، قم بتخفيف المزرعة بوسائط PSB في طبق بتري 6 سم.

ثم قم بهز المزرعة على دوار على منضدة مضبوطا على 100 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية ، الميكروويف الأول 50 مل من 1٪ أجار في مخزن DB المؤقت في قارورة سعة 250 مل. أضف 15 لترا من الكالسيوم AM إلى 15 مل من الأجار المنصهر واخلطه برفق. يسكب مزيج الأجار المنصهر في طبق زجاجي مقاس 12 × 10 سم ، ويترك الأجار يتجمد لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، استخدم مسطرة معدنية وشبكة مطبوعة لتقطيع وسادة الأجار الصلبة إلى أقسام أصغر مقاس 1.5 × 1.5 سم. تأكد من بقاء الجل رطبا حتى يصبح جاهزا للاستخدام. بعد ذلك ، لعزل الخلايا المتصلة بالسطح ، قم بإزالة الوسط السائل من طبق بتري.

ثم اغسل الطبق ب 1 مل من المخزن المؤقت للنمو لإزالة الخلايا العوالق. لفحص ضراوة الخلايا البكتيرية المرتبطة بالسطح ، أضف 10 لترات من خلايا الأميبا من الخلايا البكتيرية المرتبطة بالسطح التي تم الحصول عليها مسبقا. لعزل الخلايا العوالق ، انقل 10 لترات من المزرعة إلى طبق بتري طازج.

بعد ذلك ، قم بفحص ضراوة الخلايا العوالق عن طريق خلط 10 لترات من خلايا الأميبا مع بكتيريا العوالق التي تم الحصول عليها مسبقا. ضع على الفور وسادة أجار الصغيرة فوق خليط الأميبا البكتيري المناسب على سطح طبق بتري. بعد ذلك ، قم بإزالة السوائل الزائدة عن طريق سحب أي سائل زائد برفق ، واترك الطبق يجف لمدة 20 دقيقة.

غطي الطبق بالغطاء واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة إضافية. أخيرا ، استخدم المجهر الفلوري للحصول على صور لما لا يقل عن 100 خلية أميبا. في هذا البروتوكول ، تم فحص ضراوة الخلايا الزائفة الزنجارية العوالق والمرتبطة بالسطح.

النوع البري المرتبط بالسطح Pseudomonas aeruginosa الأميبا المشار إليه بشكل خلية أميبا مستديرة ووجود مضان الكالسين. بالمقارنة مع الخلايا العوالق ، كان النوع البري المرتبط بالسطح Pseudomonas aeruginosa لديه مؤشر قتل مضيف مرتفع. تم استهلاك الخلايا العوالق بواسطة الأميبا المشار إليها بأشكال خلايا الأميبا غير المتبلورة والقليل نسبيا من مضان الكالسين.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام مخزون جديد من الكالسين AM وخلايا الأميبا وتتبع الكثافة البصرية للأميبا عن كثب. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل توصيف النسخ من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هي الجينات التي يتم تنشيطها في العوالق والسكان الفرعيين المرتبطين بالسطح؟ بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء مقايسة الفوعة السريعة القائمة على الصورة.