Name: إعداد عينات اليرقات المورفولوجية للفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS)-على أساس جميع (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: تعلم إعداد عينات يرقات Drosophila للتحليل المستقلبي باستخدام GC-MS. يتيح هذا البروتوكول قياس أكثر من 100 مستقلب بحساسية وقابلية تكرار عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وبفضل الأعضاء في مرفق مطيافية الكتلة جامعة إنديانا وجامعة يوتا جميع مرفق الأساسية للمساعدة في الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول. J.M.T. معتمد من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم R35GM119557.

<ol><li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila%3A+implications+for+aging+and+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).</li>
<li>Sieber, M. H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+metabolic+states+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The role of metabolic states in development and disease.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larvae+synthesize+the+putative+oncometabolite+L-2-hydroxyglutarate+during+normal+developmental+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).</li>
<li>Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Estrogen-Related+Receptor+Directs+a+Metabolic+Switch+that+Supports+Developmental+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth.</a> Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).</li>
<li>Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabonomics%27%3A+understanding+the+metabolic+responses+of+living+systems+to+pathophysiological+stimuli+via+multivariate+statistical+analysis+of+biological+NMR+spectroscopic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Xenobiotica%22%5BJournal%5D)">Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data.</a> Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).</li>
<li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+-+the+link+between+genotypes+and+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes.</a> Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).</li>
<li>Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28684601">Metabolomic Studies in Drosophila.</a> Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).</li>
<li>Lenz, E. M., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17269702">Analytical strategies in metabonomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).</li>
<li>Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatography%2Fmass+spectrometry+in+metabolic+profiling+of+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B-Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).</li>
<li>Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+exogenous+to+endogenous%3A+The+inevitable+imprint+of+mass+spectrometry+in+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).</li>
<li>Garcia, A., Barbas, C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/book/10.1007%2F978-1-61737-985-7">Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology</a>. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).</li>
<li>Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+urinary+metabolic+profiling+procedures+using+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).</li>
<li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).</li>
<li>Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glue+secretion+in+the+Drosophila+salivary+gland%3A+a+model+for+steroid-regulated+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis.</a> Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).</li>
<li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetAlign%3A+Interface-driven%2C+versatile+metabolomics+tool+for+hyphenated+full-scan+mass+spectrometry+data+preprocessing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing.</a> Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li>
<li>Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboAnalyst+3.0-making+metabolomics+more+meaningful%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).</li>
<li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+%28pre-%29processing+of+nominal+and+accurate+mass+LC-MS+or+GC-MS+data+using+MetAlign%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign.</a> Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+inference+of+biological+patterns%2C+functions+and+pathways+from+metabolomic+data+using+MetaboAnalyst%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst.</a> Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).</li>
<li>Li, H., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

جميع يوفر فرصة لا مثيل لها لدراسة التفاعلات الأيضية التي تؤلف أيض وسيطة. الحساسية لهذه التكنولوجيا، ومع ذلك، يجعل البيانات عرضه للخلفية الوراثية والعظة التنموية، ومجموعة متنوعة من الضغوط البيئية، بما في ذلك درجة الحرارة، والرطوبة، والكثافة السكانية، وتوافر المغذيات. ولذلك، عالية يتطلب تحليل جميع الجودة واستنساخه بجمع العينات تحت ظروف خاضعة للرقابة عاليا. بينما تؤكد عدة ملاحظات على هذه النقطة3،،من823، هنا نقدم أسلوب خطوة بخطوة لج...

ذبابة الفاكهة melanogaster المورفولوجية برز كنظام مثالي لدراسة الآلية الجزيئية التي تنظم الأيض الوسيطة. ليس فقط هي حفظت معظم الأيضية بين البشر و المورفولوجية ، ولكن أجهزة الاستشعار المغذيات الرئيسية ومنظمات النمو، مثل الأنسولين، تور، وحركة، تنشط أيضا في أن يطير1،2. كنتيجة لذلك، يمكن استخدام المورفولوجية لاستكشاف الأساس الأيضي للأمراض البشرية تتراوح بين مرض السكري والسمنة نيوروديجينيريشن والسرطان. وفي هذا الصدد، وضع اليرقات المورفولوجية يوفر الإطار المثالي لدراسة برنامج الاستقلابية المعروفة بتحلل الهوائية، أو تأثير واربورغ. تماما كما استخدم العديد من الأورام تحلل الهوائية لتوليد طاقة الكتلة الأحيائية من الكربوهيدرات، حتى للقيام المورفولوجية اليرقات تنشيط تحلل الهوائية لتعزيز النمو التنموي3،،من45. أوجه التشابه هذه بين اليرقات والتمثيل الغذائي الورم تنشئ المورفولوجية كنموذج رئيسي لفهم كيف الهوائية تحلل التنظيم في فيفو.
وعلى الرغم من حقيقة أن الطاير قد برز كنموذج شعبية لدراسة الأيض، تعتمد معظم الدراسات المورفولوجية على الأساليب التي تم تصميمها لقياس نواتج الأيض الفردية3، مثل تريهالوسي أو الشحوم ATP. منذ بروتوكول معين مطلوب لقياس كل المستقلب، الدراسات على أساس مقايسة كثيفة العمالة ومكلفة، ومنحازة إلى تلك المركبات التي يمكن أن تقاس باستخدام مجموعات تجارية. التوصل إلى حل لهذه القيود برز من الحقل لجميع، الذي يوفر وسيلة أكثر كفاءة وغير متحيزة لدراسة الأيض المورفولوجية . خلافا لدراسة على أساس المقايسة، يمكن إجراء تحليل metabolomic واحد في نفس الوقت قياس المئات من جزيء صغير من الأيض وتوفير فهم شامل للكائن الحي حالة ايضية6،7. هذا الأسلوب اتسع إلى حد كبير نطاق الدراسات المورفولوجية الأيضية ويمثل مستقبل هذا المجال الناشئ8.
وتجري دراسات Metabolomic أساسا باستخدام ثلاث تقنيات: (ط) الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) و (ثانيا) السائل اللوني-الكتلي (LC-MS) (ثالثا) الفصل اللوني للغاز-قياس الطيف الكتلي (GC-MS)9. يقدم كل نهج متميز من مزايا وعيوب، وكل من هذه التقنيات قد استخدمت بنجاح دراسة الأيض المورفولوجية . نظراً للبحث الذي أجرى في المختبر لدينا يركز على نواتج الأيض الصغيرة، والقطبية، نحن نوظف أسلوب GC-MS-تعتمد أساسا. GC-MS ويوفر للمستخدم مع عدد من المزايا، بما في ذلك إمكانية تكرار نتائج عالية، القرار الذروة، والحساسية، وتوفر مكتبة الطيفية الأثر (الصناعات الاستخراجية) إلكترون القياسية التي تسمح التعرف السريع على اكتشاف الأيضية ميزات10،11. ومع ذلك، إعداد العينات ل GC-MS، معقد نوعا ما ويتطلب عناية بالتفاصيل. يجب جمع العينات وغسلها ووزنه والمجمدة بطريقة يروي بسرعة التفاعلات الأيضية. وعلاوة على ذلك، الذبيحة يطير مقاوم للبروتوكولات القياسية التجانس ويتطلب طاحونة حبة لضمان استخراج المستقلب الأمثل. وأخيراً، يجب أن تخضع العينات التي تم تحليلها بواسطة GC-MS derivatization الكيميائية قبل الكشف عن12. بينما تصف الأساليب المنشورة سابقا كل هذه الخطوات3،،من1314، يزال يلزم بروتوكول بصرية التي تسمح للمستخدم المبتدئ بتكاثر توليد بيانات عالية الجودة. هنا نظهر كيفية تحضير عينات اليرقات المورفولوجية لتحليل جميع GC-MS-تعتمد. يسمح هذا البروتوكول المستخدم لقياس العديد من نواتج الأيض القطبية الصغيرة التي تؤلف استقلاب الكربون وسط تكاثر.

<table><tbody><tr><td>دبس السكر الأسود غير الكبريت</td><td>Good Food ، INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ذبابة الفاكهة أجار النوع الثاني</td><td>جينيسي العلمي</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>بيريدين</td><td>EMD ميليبور</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>ميثوكسيأمين هيدروكولوريد (موكس)</td> <td>MP Biomedicals، LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA مع 1٪ ثلاثي ميثيل كلوروسيلان</td><td>سيجما</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>فليشمان s الخميرة الجافة النشطة</td><td>AB Mauri Food Inc</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>6 أوقية ذبابة الفاكهة زجاجة</td><td>مخزون جينيسي العلمية</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>مزيج تجانس الأنسجة الرخوة (2 مل أنابيب) &nbsp ؛</td><td>Omni International</td><td>SKU: 19-627</td><td></td></tr><tr><td>إدراج قارورة ، 250 & micro ؛ L الزجاج المعطلة مع أقدام البوليمر</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>حمض السكسينيك-2،2،3،3-d4</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo &nbsp;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-phosphoric</td><td>acid Fisher Scientific</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>حمض البروبيونيك</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxy حمض البنزويك ميثيل استر</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>شاكر MultiTherm مع كتلة 24 × 12 مم</td><td>معياري Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>1.5 مل أنبوب طرد مركزي</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 × 10 مم طبق زراعة</td><td>الأنسجة Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>عمود GC</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

إعداد عينات اليرقات المورفولوجية للفصل اللوني للغاز-الكتلي (gc-ms)-على أساس جميع

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

وقد أنشأت التطورات الأخيرة في هذا مجال جميع ذبابة الفاكهة melanogaster المورفولوجية كنموذج وراثية قوية لدراسة الأيض الحيواني. عن طريق الجمع بين مجموعة واسعة من أدوات المورفولوجية الوراثية مع القدرة على مسح مساحات كبيرة من الأيض الوسيطة، يمكن أن تكشف عن نهج جميع التفاعلات المعقدة بين النظام الغذائي والوراثي وتاريخ حياة الأحداث ومنبهات بيئية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اكتشاف الآليات الانزيمية رواية جميع الدراسات وكشف اتصالات مجهولة بين المسارات الأيضية التي تبدو متباينة. من أجل تيسير توسيع نطاق استخدام هذه التكنولوجيا مجتمع المورفولوجية ، هنا نقدم بروتوكول تفصيلية التي توضح هذه المقالة كيفية إعداد عينات اليرقات المورفولوجية للفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS)- على أساس تحليل metabolomic. لدينا بروتوكول يتضمن وصفاً لجمع العينات اليرقات واستخراج المستقلب، derivatization الكيميائية وتحليل GC-MS. النجاح في إنجاز هذا البروتوكول سوف تسمح للمستخدمين لقياس الوفرة النسبية لنواتج الأيض القطبية الصغيرة، بما في ذلك الأحماض الأمينية والسكريات والأحماض العضوية تشارك في دورات TCA وتحلل.

لاكتات نازعة المسوخ (دلده)، والتي تفتقر إلى النشاط دلده4، وعناصر مطابقة وراثيا وجمعت يرقات منتصف L2 وتجهيزها وفقا للبروتوكول المذكورة أعلاه. عند مقارنة مع عناصر التحكم، اليرقات متحولة يحمل تغييرات كبيرة في لاكتات، بيروفات ول-2-هيدروكسيجلوتاراتي4. تم اقتناء الأطياف مع نظام اجيلنت GC6890-5973i مرض التصلب العصبي المتعدد. مثال من أطياف GC-MS تولد مع لدينا بروتوكول ويرد في الشكل 1. وهناك العديد من الميزات ال...

ويصف هذا البروتوكول كيفية إعداد اليرقات المورفولوجية لتحليل GC-MS-تعتمد metabolomic.

إعداد عينات اليرقات المورفولوجية للفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS)-على أساس جميع

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التمثيل الغذائي ، مثل كيفية تصنيع أونيكوميتابوليت L2-هيدروكسي جلوتارات في الخلايا السليمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للمستخدم بقياس أكثر من 100 مستقلب بشكل مباشر بطريقة حساسة وقابلة للتكرار. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن البروتوكول يتطلب معالجة فعالة للعينات وحساس للغاية لبخار الماء.لبدء البروتوكول ، أضف ملليلترا واحدا من كلوريد الصوديوم المثلج 0.9٪ في أنبوب سعة 1.5 مليلتر يحتوي على يرقات معدة مسبقا. أغلق الغطاء ، واقلب الأنبوب عموديا لغسل اليرقات جيدا ، وضع الأنبوب على الجليد لمدة 30 ثانية. سوف تغرق اليرقات في قاع الأنبوب ، لكن الخميرة ستبقى معلقة.بمجرد أن تشكل جميع اليرقات حبيبات فضفاضة ، قم بإزالة محلول كلوريد الصوديوم باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد. الطرد المركزي للعينات عند 2,000 غرام لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة جميع المحاليل المتبقية باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، وقم بتجميد العينة على الفور في النيتروجين السائل.استخدم علامة مقاومة للإيثانول لتسمية جانب أنبوب حبة بغطاء لولبي سعة ملليلتر. بعد ذلك ، قم بتفريغ كتلة أنبوب الخرزة المسمى باستخدام ميزان تحليلي قادر على قياس 0.01 ملليغرام بدقة. استخدم ملقطا طويلا لإزالة أنبوب العينة سعة 1.5 ملليلتر من ديوار النيتروجين السائل.ارتداء قفازات النتريل ، أمسك الأنبوب المجمد ، واقلبه ، واضرب غطاء الأنبوب بحدة على سطح الطاولة لإخراج الحبيبات المجمدة. صب الحبيبات على الفور في أنبوب حبة بغطاء لولبي ملليلتر مسبق القطران. يجب معالجة العينة بسرعة لضمان عدم إعادة تنشيط مسارات التمثيل الغذائي الداخلية.قم بقياس الكتلة المجمعة لحبيبات اليرقات وأنبوب الخرزة بسرعة. ضع أنبوب العينة على الفور في النيتروجين السائل. ضع أنابيب العينة في مبرد سالب 20 درجة مئوية.أضف 0.8 مل من الميثانول المبرد مسبقا بنسبة 90٪ يحتوي على ميكروغرامين لكل ملليلتر من حمض السكسينيك D4 في كل أنبوب. أعد العينات إلى مبرد سطح الطاولة سالب 20 درجة مئوية. قم بإعداد عنصر تحكم سلبي عن طريق إضافة 0.8 مل من الميثانول المبرد مسبقا بنسبة 90٪ الذي يحتوي على ميكروغرامين لكل ملليلتر من حمض السكسينيك D4 في أنبوب حبة فارغ.بعد ذلك ، قم بتجانس العينات لمدة 30 ثانية بسرعة 6.45 متر في الثانية باستخدام مجانس مطحنة الخرز الموجود في غرفة التحكم في درجة الحرارة بأربع درجات مئوية. أعد العينات المتجانسة إلى المبرد السطحي سالب 20 درجة مئوية ، وانقل المبرد إلى فريزر سالب 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 20،000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة الراسب الناتج.انقل 600 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر ، ولا تزعج الرواسب. افتح جميع أنابيب العينة وضعها في جهاز طرد مركزي مفرغ. جفف العينات في درجة حرارة الغرفة حتى تتم إزالة كل المذيبات.إذا تم تخزين العينات المجففة عند سالب 80 درجة مئوية ، فضع أنابيب العينة غير المفتوحة في جهاز طرد مركزي مفرغ وجففها لمدة 30 دقيقة. تحضير محلول 40 ملليغرام لكل مليلتر ميثوكسيلامين هيدروكلوريد ، أو MOX ، في البيريدين اللامائي قم بتخزين MOX والبيريدين في مجفف.بعد ذلك ، استخدم مسدسا حراريا لتجفيف حقنة زجاجية سعة مليلتر واحد لمدة خمس ثوان تقريبا. أدخل إبرة المحقنة في زجاجة البيريدين اللامائية. قم بإزالة مليلتر واحد من البيريدين وأضفه إلى أنبوب ميكرو فيوج يحتوي على 40 ملليغرام من MOX.هذا الجزء من البروتوكول حساس للغاية للماء. يجب تخزين جميع الكواشف في مجفف قبل الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على المستخدم التأكد من أن العينة لديها الحد الأدنى من التعرض لبخار الماء في الغلاف الجوي.ثم اغسل زجاجة البيريدين اللامائي بالأرجون. أغلق الزجاجة وأعيدها إلى المجفف. قم بإذابة MOX في البيريدين عن طريق احتضان الأنبوب في خلاط حراري عند 35 درجة مئوية لمدة 10 دقائق عند 600 دورة في الدقيقة.بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من 40 ملليغرام لكل مليلتر MOX في محلول بيريدين اللامائي إلى العينة المجففة. دوامة العينة لمدة 10 ثوان ، وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة. ثم احتضان العينة في الخلاط الحراري.الطرد المركزي العينة عند 20،000 جم أو السرعة القصوى لمدة خمس دقائق لإزالة الجسيمات. انقل 25 ميكرولترا من المادة الطافية إلى قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكية مع ملحق زجاجي صغير الحجم غير نشط سعة 250 ميكرولتر. أضف 40 ميكرولترا من MSTFA تحتوي على 1٪ TMCS.ضع غطاءا على قارورة أخذ العينات التلقائية ، وأغلق القارورة باستخدام أداة المكشكش. احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع الرج عند 250 دورة في الدقيقة. أخيرا ، أضف ثلاثة ميكرولترات من معيار إستر ميثيل الأحماض الدهنية المعد مسبقا ، أو محلول FAMES ، إلى قارورة أخذ العينات التلقائية باستخدام جهاز أخذ العينات الآلي الآلي مباشرة قبل الحقن.تظهر الكروماتوغرافيا الغازية - مطياف الكتلة لليرقات الطافرة نازعة هيدروجين اللاكتات تغيرات كبيرة في اللاكتات والبيروفات و L2-هيدروكسي جلوتارات مقارنة باليرقات الضابطة. تظهر أطياف GC-MS التي تم إنشاؤها باستخدام البروتوكول العديد من الميزات المرئية وذروة ملحوظة للتريهالوز ، والتي تمثل عادة أكبر ذروة في عينة اليرقات. يظهر تحليل المكونات الأساسية ، أو PCA ، بوضوح أن المجموعات من النوع المغلوب والبري تنفصل عن بعضها البعض وأنه لا يوجد غريب في أي من المجموعتين.أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء العينات مجمدة قبل التجانس والحفاظ على جميع الكواشف جافة طوال الإجراء.

preparation-drosophila-larval-samples-for-gas-chromatography-mass

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

يوصف التنميط النظائر مستقرة التحليل اللوني للغاز الكتلة الطيفي لتدفق الاستقلابية المتوسطة في الديدان...

النظائر مستقرة من التنميط التمويه الاستقلابية المتوسطة في مرحلة تطوير والكبار انواع معينة ايليجانس</em

نحن هنا وصف الإجراءات لاستخراج وتنقية ومرنا من...

تنقية النصوص والأيضات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء

تلعب الميتوكوندريا أدوارا مركزية في تنظيم التمثيل الغذائي والتوازن. قد يكون من الصعب اكتشاف التغيرات الطفيفة في عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا التي تؤثر على فسيولوجيا الكائن الحي في دراسات التمثيل الغذائي للكائن الحي بأكمله. نصف هنا طريقة عزل تعزز الكشف عن التحولات الأيضية الدقيقة في ذبابة الفاكهة السوداء.

إعداد الميتوكوندريا المخصب الكسور لتحليل التمثيل الغذائي في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نهج مباشر وغير مكلفة لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط ​​(0.5-1 ز) وإعداد مقتطفات البروتين التي يمكن استخدامها في التطبيقات البروتين المصب، مثل تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس ).

إعداد على نطاق متوسط ​​من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مقتطفات الجنين للتجارب بروتيوميك

يتم تشريح العمال القصر من أنواع النمل اكسبلودينس كولوبوبسيس لعزل المحتوى مثل الشمع المخزنة في الخزانات الغدة الفك السفلي لامداده بهم لاستخراج المذيبات اللاحقة والتحليل بواسطة الفصل اللوني للغاز-قياس الطيف الكتلي. ويرد أيضا الشرح وتحديد المكونات المتطايرة باستخدام برمجيات المصدر المفتوح ميتابوليتيديتيكتور.

عزل محتويات الخزان الغدة الفك السفلي من Bornean ' تنفجر النمل (Formicidae) لتحليل فولاتيلومي GC-MS وميتابوليتيديتيكتور

هذا البروتوكول وصف أسلوب لزراعة ايليجانس كاينورهابديتيس على نطاق واسع في وسائل الإعلام الصلبة. كبديل لثقافة السائل، يسمح هذا البروتوكول الحصول على معلمات جداول مختلفة المزروعة المستندة إلى اللوحة. وهذا يزيد من قابلية النتائج للمقارنة بإهمال الاختلافات المورفولوجية والأيضية بين ثقافة وسائل الإعلام السائلة والصلبة.

زراعة الواسعة النطاق على أساس لوحة ايليجانس كاينورهابديتيس: "إعداد نموذج" "دراسة التعديلات الأيضي" في مرض السكري

ويصف هذا البروتوكول سرعة نقل واحد للتقنيات التحليلية واوميكس تكميلية بلغت ذروتها في توصيف إقران تماما من المواد العضوية الطبيعية والبروتينات الميكروبية في النظم الإيكولوجية المختلفة. ويسمح هذا النهج مقارنات قوية لتحديد المسارات الأيضية والتحولات الهامة لوصف إنتاج غازات الدفيئة والتنبؤ بالاستجابات للتغير البيئي.

واحد الإنتاجية التكميلية التقنيات التحليلية عالية الدقة لوصف خليط معقد من المواد العضوية الطبيعية

في هذا البروتوكول ، نقدم سير عمل محسن ، يجمع بين إعداد عينة فعالة وسريعة للعديد من العينات. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم دليلا خطوة بخطوة لتقليل الاختلافات التحليلية لتقييم الإنتاجية العالية لدراسات GWAS الأيضية.

دراسات الارتباط واسعة النطاق متعددة الأوميكس على نطاق الجينوم (Mo-GWAS): مبادئ توجيهية لإعداد العينات وتطبيعها

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير إرشادات مفصلة حول إعداد العينات المناسبة لتحليل الدهون والمستقلب في الأنسجة الصغيرة ، مثل دماغ ذبابة الفاكهة ، باستخدام تصوير الطيف الكتلي بالامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI).

إعداد العينات للتحليل السريع للدهون في دماغ ذبابة الفاكهة باستخدام التصوير الطيفي الكتلي للارتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة

هنا، نقدم بروتوكول لعزل الأنسجة الغدد التناسلية من الزرد اليرقات، التي من شأنها تسهيل التحقيقات في التفرقة بين جنس الزرد والصيانة.

تشريح اليرقات الزرد الغدد التناسلية الأنسجة

تعلم إعداد عينات يرقات Drosophila للتحليل المستقلبي باستخدام GC-MS. يتيح هذا البروتوكول قياس أكثر من 100 مستقلب بحساسية وقابلية تكرار عالية.

إعداد عينات اليرقات المورفولوجية للفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS)-على أساس جميع

استكشف المزيد من الفيديوهات