الجمع بين تحليل للحمض النووي في مجال استخراج النفط خام Virion بتحليل الحمض النووي الريبي من الأوراق المصابة اكتشاف جينومات الفيروس الجديد

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول علم الفيروسات البيئية، مثل ظهور أمراض جديدة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في تنقية المتغيرات بعيداً عن المكونات الخلوية واستخدام تلك المتغيرات لاستخلاص الـ DNA بغرض التسلسل الجيني. لقد خطرت لي هذه الفكرة لأول مرة عندما اكتشفنا أن النباتات في دفيئاتنا مصابة بواحد أو أكثر من فيروسات Badnaviruses المجهولة. قد يواجه المبتدؤون في هذه الطريقة صعوبات لثلاثة أسباب؛ أولاً، يعد التجانس خطوة حاسمة لضمان الحصول على عوائد ذات جودة عالية. ثانياً، يمكن أن ينتج عن الطرد المركزي التفاضلي عدة رواسب، ويجب أن تعرف كيفية تحديد تلك الرواسب وفصلها. ثالثاً، قد يكون تفسير نتائج جهاز تحليل الجزيئات الحيوية (bio-analyzer) صعباً أيضاً.

يجب ارتداء معطف المختبر وقفازات طوال جميع خطوات هذا الإجراء. ابدأ بقص 80 إلى 100 جرام من أوراق النباتات المصابة التي تم تجميدها مسبقاً عند درجة حرارة 20- °C. بعد ذلك، اطحن الأوراق في خلاط Waring باستخدام 200 milliliters من محلول الطحن المنظم و 0.5% كبريتيت الصوديوم. انقل المتجانس إلى دورق سعة لتر واحد.

مع الاستمرار في ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، أضف 18 grams من urea و 25 milliliters من منظف غير أيوني بتركيز 10% إلى المستخلص المتجانس وقم بتغطية الكأس بورق ألومنيوم. اخلط المزيج باستخدام محرك مغناطيسي طوال الليل. وفي اليوم التالي، انقل المستخلص المتجانس إلى زجاجات دوارة لجهاز الطرد المركزي سعة 250 milliliter، ثم قم بطردها مركزياً في دوارة ذات زاوية ثابتة بسرعة 4000 ×g عند درجة حرارة أربع degrees Celsius لمدة 10 minutes. اجمع السائل الطافي وقم بترشيحه عبر أربع طبقات من الشاش. قم بقياس حجم المستخلص السائل المسترجع، ثم قسم المستخلص على أنابيب طرد مركزي من البولي بروبيلين سعة 38.5 milliliter. قم بطرد المستخلص مركزياً بسرعة 40,000 ×g عند درجة حرارة أربع degrees Celsius لمدة 2.5 hours. عند انتهاء عملية الطرد المركزي، تحقق من وجود راسب أخضر في قاع الأنبوب وراسب أبيض على طول الأنبوب. اسكب السائل الطافي مع الاحتفاظ بكلا الراسبين، ثم ضع العينات على الثلج.

يعد فصل الراسب الأبيض عن الراسب الأخضر إحدى أصعب الخطوات في هذا الإجراء، وهي تتطلب الصبر والمهارة.

باستخدام خزانة استخلاص كيميائية، استخدم ماسحة مطاطية (rubber policeman) لفصل الكريات. اكشط الكريات وانقلها إلى زجاجات دوارة مختلفة. ضع الزجاجات الدوارة التي تحتوي على الكريات البيضاء على الثلج. أضف 1 mL من الماء إلى كل زجاجة، ثم اسحب السائل وأخرجه باستخدام الماصة عدة مرات. وخلال فترة تتراوح من ساعة إلى ساعتين، وبمعدل مرة كل خمس دقائق، قم بعملية السحب والإخراج بالماصة للمزيج لإعادة تعليق الكريات. بعد إعادة تعليق الكريات البيضاء، احفظ المعلقات طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.

في اليوم التالي، قم بطرد المعلق مركزياً عند 6000 ×g في درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة الحطام المتبقي. انقل المعلقات المركزة إلى أنابيب جديدة وقم بطردها مركزياً عند 136,000 ×g في درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة ساعتين لترسيب الفيريونات. تخلص من الراشح وأعد تعليق الراسب في واحد ملليمتر من المحلول المنظم.

ابدأ هذا الإجراء بتفكيك الفيريونات. أضف 40 µL من محلول proteinase K بتركيز 2 µg/µL إلى معلقات الرواسب واحضنها عند 37 °C لمدة 15 دقيقة. أضف حجماً واحداً من phenol chloroform isoamyl alcohol إلى كل عينة ورجها يدوياً لمدة 20 ثانية.

قم بالطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 16,000 ×g لمدة خمس دقائق. أزل الطور المائي العلوي وانقله إلى أنبوب جديد. كرر عملية الاستخلاص هذه مرتين أو أكثر.

قم بتركيز الـ DNA باستخدام الترسيب بالإيثانول. استخدم أسيتات الصوديوم بتركيز 0.3 مولار وpH 5.2، و2.5 حجم من الإيثانول بتركيز 95%. ضع العينات عند درجة حرارة -20 °C لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 دقيقة. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي بسرعة 13,000 ×g لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة لترسيب الـ DNA.

عند العمل على طاولة المختبر، أعد تعليق كتلة DNA في واحد مليليتر من منظم TE بتركيز 0.1 ملي مولار. قم بترشيح المعلق عبر عمود ترشيح هلامي تجاري بواسطة الطرد المركزي. حلل العينات عن طريق الرحلان الكهربائي بهلام الأجاروز بتركيز 1% باستخدام صبغ بروميد الإيثيديوم لمعاينة جودة التحضيرات وتقييم جودة DNA كما هو موضح في النص.

عند الفحص باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ، ظهرت جسيمات فيروسية في الراسب الأبيض المستخلص عن طريق التجزيء الخام لأوراق نبات الكنا المصابة. وقد حدد الرحلان الكهربائي للحمض النووي DNA المستخلص من الراسبين الأخضر والأبيض على هلام الأغاروز وجود نطاقين من الـ DNA عالي الوزن الجزيئي في الجزء الأبيض، واللذين تشير إليهما النقطتان الحمراء والصفراء.

تم أيضاً التحقق من سلامة الـ RNA المستخلص من الأوراق المصابة عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الأجاروز. يوضح هذا المخطط وفرة وتوزيع التتابعيات المتصلة (contigs) التي تم تجميعها من تحضير الفيروس الخام. ويصور هذا المخطط نسب التتابعيات الفيروسية المرتبطة بفصيلة Caulimoviridae، وجنس Badnavirus، والتتابعيات المرتبطة بثلاثة أنواع وثيقة الصلة.

يوضح المخططان التاليان وفرة القطع المتصلة (contigs) المشتقة من تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA sequencing) بناءً على توزيعها التصنيفي. يصور المخطط الموجود على اليمين وفرة القطع المتصلة ضمن مجموعة القطع المتصلة الفيروسية المرتبطة بجنس Badnavirus من عائلة Caulimoviridae وثلاثة أنواع وثيقة الصلة. وتؤكد مقارنة أطوال القطع المتصلة للجينوم الفيروسي الناتجة عن تسلسل DNA وRNA كركيزة متبادلة وجود جينومين فيروسيين كاملين.

وفي الختام، كشف تحليل RT-PCR باستخدام RNA المستخلص من الأوراق المصابة بالفيروس عن وجود جينومي كلا الفيروسين.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن أن تستغرق يومين، بينما قد يستغرق المبتدئ ثلاثة أيام. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء للمرة الأولى، من المهم تسجيل حجم المتجانس في كل من السوائل الطافية حتى تتمكن في نهاية الإجراء من مقارنة الحصيلة النهائية من الـ DNA مع المادة البادئة الأولية.

بعد اكتشافها، مهدت هذه الطريقة الطريق في مجال فيروسات النباتات للباحثين لتحديد فيروسات DNA جديدة في البيئة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجانس المادة النباتية، وتركيز المتغيرات، والحصول على محصول جيد من DNA يمكن استخدامه في تسلسل الجيل القادم. لا تنسَ أن العمل باستخدام urea و phenol chloroform خطير للغاية، ويجب دائمًا اتخاذ احتياطات مثل ارتداء النظارات الواقية، والقفازات، ومعطف المختبر، والقناع عند التعامل مع هذه المواد الكيميائية. ولضمان سلامة الطرد المركزي الفائق، من المهم موازنة الأنابيب بشكل صحيح، لذا يجب وزنها ووضعها في مواجهة بعضها البعض في الدوارة، كما يجب أن يكون فرق الوزن بينهما في حدود 0.01.