أسلوب الغازية لتفعيل المغزلي المسنن الماوس بتحفيز عالية التردد

الهدف العام من هذه التجربة هو مراقبة تأثير التحفيز عالي التردد على نشاط الخلايا العصبية في تكوين الخلايا العصبية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الآليات الخلوية والجزيئية المحاذاة لتحفيز الدماغ العميق عالي التردد ، مثل تحريض نشاط الخلايا العصبية وتكوين الخلايا العصبية في الحصين. تتمثل ميزة هذه التقنية في أنها توضح التأثير القوي لمتلازمة السل عالية التردد على نشاط الخلايا العصبية وتكوين الخلايا العصبية في دماغ البالغين.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتأثيرات TBS عالي التردد على التلفيف المسنن للفأر ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل العقد القاعدية والمناطق تحت المهاد لاضطرابات الدماغ في العيادة. لبدء هذا الإجراء ، ضع فأرة مخدرة على الإطار التجسيمي. قم بمحاذاة عصابات الأذن مع رأسها ، وشدها برفق لدعم الرأس المنتصف.

أمسك الجلد الأمامي بأذنيه وقم بإزالة حوالي سنتيمتر مربع واحد منه فوق الجمجمة. ثم قم بإزالة العضلات وغيرها من المرفقات التي تغطي الجمجمة بقطعة قطن لكشف سطح الجمجمة. بعد ذلك ، قم بتطبيق محلول بيروكسيد الهيدروجين لتجفيف الجمجمة من أجل تحديد خطوط خياطة السهمية واللامدا.

ثم حدد بريجما ولامدا. سيتم استخدام نقطة بريجما كنقطة أصلية لضبط موضع النواة. بعد ذلك ، قم بتسوية الجمجمة على المستوى الأفقي باستخدام هاتين النقطتين.

تأكد من أن ارتفاعات هاتين النقطتين متماثلة تقريبا في المستوى البطني الظهري. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من تسوية الجمجمة في المستوى الجانبي الإنسي. بعد ذلك ، قم بتركيب قطب كهربائي من الأسلاك النحاسية الصغيرة ذات قناتين محلي الصنع في حامل القطب الدوار على الإطار الجراحي التجسيمي.

ضع القطب الكهربائي مباشرة فوق بريجما واضبطه كموقع أصلي. بعد ذلك ، حرك القطب برفق إلى الموضع الصحيح فوق الجمجمة ، دون لمسه. استخدم الشاشة الرقمية على الإطار الجراحي التجسيمي للإشارة إلى المواضع الأمامية الخلفية والجانبية الإنسية والظهرية البطنية.

عندما يتم تحديد الموقع المطلوب لإدخال القطب الكهربائي ، ضع علامة على الموضع بعلامة سوداء. بعد ذلك ، استخدم التعديلات التجسيمية الظهرية البطنية لرفع حامل القطب. ثم قم بتعقيم مثقاب بنسبة 70٪ من الإيثانول.

استخدم مثقابا محمولا بمساعدة مناور دقيق ، وقم بعمل ثقب لدغ بدقة في الموضع المحدد. استخدم قطعة قطن معقمة لوقف أي نزيف أثناء العملية. استمر في الحفر حتى تتعرض الجافة.

استخدم إبرة مثنية لإزالة أي بقايا عظمية تتولد أثناء الحفر ، وقم بعمل ثقب على الجافية دون الإضرار بأنسجة الدماغ الرخوة الأساسية. للتأكد من أن ثقب الأزيز قد تم إجراؤه بشكل صحيح في الموضع المطلوب ، قم بخفض القطب الكهربائي للتأكد من إدخاله عبر فتحة الأزيز بسلاسة دون لمس أي عائق. إذا لم يتم الكشف عن أي مقاومة ، فأدخل القطب ببطء إلى العمق المستهدف من سطح الجمجمة.

ثم ضع أسمنت الأسنان باستخدام ملعقة صغيرة لتثبيت القطب في مكانه. عندما يتكاثف الأسمنت ، قم بتشكيله حول القطب الكهربائي المدرج ومسامير العظام الأخرى لتشكيل غطاء لطيف وسلس. بعد ذلك ، قم بفصل القطب الكهربائي عن حامل القطب.

قم بإزالة الماوس من الإطار التجسيمي ، وأعده إلى قفص دافئ. دع الماوس يتحرك بحرية واتركه يتعافى لمدة يومين في القفص. لتقديم التحفيز ، قم بتوصيل القطب المزروع بمحفز قابل للبرمجة عبر الأسلاك.

قم بإعداد واجهة البرنامج. بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات HFS على أنها ست سلاسل من ستة قطارات من ستة نبضات عند 400 هرتز ، وشدة التحفيز 200 مللي أمبير. قم بتسليم HFS للفترة الزمنية المطلوبة كما تم إعدادها.

بالنسبة للمجموعة الضابطة ، قم بزرع أقطاب كهربائية في الفئران دون تقديم أي تحفيز. بالنسبة لتلوين CFAS ، حفز الفئران التجريبية مرتين ليوم واحد. بالنسبة لوضع العلامات على BrdU ، قم بتطبيق المحفزات المناسبة لكل من مجموعة التحفيز الحاد ومجموعة التحفيز المزمن.

أثناء التحفيز ، تأكد من أن الفأر مستيقظ. تذكر أن تتأكد من أن العملاء المحتملين غير ملتويين. عند الانتهاء من التحفيز ، افصل دبوس القطب بعناية عن حامل القطب الكهربائي في موصل نظام التسجيل.

بالنسبة ل CFAS وتلوين واحد ، بعد حوالي ثلاث ساعات من آخر HFDBS ، قم بتخدير الفئران عن طريق حقن البنتوباربيتال لتحقيق مستوى جراحي للتخدير. بالنسبة لوضع العلامات على BrdU ، بعد حوالي 12 ساعة من آخر تحفيز HFDBS ، أعط ستة حقن من BrdU للتحكم والفئران المحفزة كل ساعتين. بعد 36 ساعة من الحقن الأخير ، قم بتخدير الفئران بعمق باستخدام البنتوباربيتال وقم بغزارها عبر القلب ب 50 مل من PBS البارد متبوعا ب 50 مل من البارد 4٪ بارافورمالدهايد.

قم بإزالة رأسه وقم بعمل شق على الجلد لفضح المهارة. باستخدام الملقط ، قم بتقطيع الجمجمة قليلا وإزالة الدماغ بالكامل بعناية. بعد ذلك ، بعد إصلاح الدماغ هو 4٪ بارافورمالدهيد لمدة يومين إضافيين ، ونقله إلى محلول سكروز بنسبة 30٪ عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

باستخدام ناظم البرد ، قم بتقطيع الدماغ إلى أقسام إكليلية بحجم 20 ميكرون. انقل الأقسام وقم بتثبيتها على الشريحة الزجاجية بفرشاة ، وقم بتخزينها على درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى PBS عادي لا يحتوي على مثبت.

اغسل الأقسام باستخدام PBS ثلاث إلى أربع مرات لمدة خمس دقائق لكل منها لإزالة أي مثبت زائد. بالنسبة للمجموعة المسماة BrdU ، احتضن الأقسام في اثنين من حمض الهيدروكلوريك المولي لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، واشطفها في محلول بورات 0.1 مولار. بعد 10 دقائق ، اغسل الأقسام مرتين في PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة.

بعد ذلك ، احتضان الأقسام في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضان الأقسام بجسم مضاد متعدد النسيلة مضاد ل CFAS ، أو جسم مضاد مضاد واحد ، أو جسم مضاد مضاد ل BrdU في محلول مانع عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. كانت الأقسام ثلاث مرات في PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة ، ثم احتضنها باستخدام Alexa Fluor 568 المترافق المضاد للداء بالكلب ، أو Alexa Fluor 488 المترافق المضاد للماعز ، أو Alexa Fluor 488 الجسم المضاد الثانوي المترافق المضاد للفئران لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

كانت الأقسام ثلاث مرات في PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة. بعد ذلك ، قم بتغطية أقسام الدماغ ذات العلامات المناعية باستخدام وسيط تركيب كاشف مضاد للبهتان يحتوي على DAPI. دع الأقسام تجف في الهواء ، وقم بتخزينها محمية من الضوء عند أربع درجات مئوية.

يظهر هنا نموذج تجريبي لعلاج HFS في جيل BrdU المسمى الخلايا العصبية المتكاثرة في DG. تم تقسيم إلى مجموعة حادة ومزمنة لتلقي أنماط مختلفة من التحفيز. بعد ذلك ، تم حقن في كلتا المجموعتين ب BrdU في اليوم السادس. في اليوم الثامن ، تم تخدير وغزارة لإعداد أقسام ناظم البرد.

فيما يلي صور تلطيخ الفلورسنت المناعي BrdU بعد HFDBS في DG. أشار التحليل الكمي لإنتاج الخلايا العصبية إلى أن التحفيز الحاد في DG لا يمكن أن يعزز تكوين الخلايا العصبية. في حين أن التحفيز المزمن في DG ينظم بشكل كبير تكوين الخلايا العصبية. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، زاد عدد خلايا وضع العلامات BrdU بشكل ملحوظ في المجموعة المزمنة ، سواء في نصف الكرة الأرضية المماثل أو المقابل.

هذه هي صور تلطيخ الفلورسنت المناعي BrdU بعد HFDBS في المنطقة الفرعية PP. أشار التحليل الكمي لإنتاج الخلايا العصبية إلى أن التحفيز الحاد أو المزمن في PP لا يمكن أن يعزز تكوين الخلايا العصبية بشكل كبير. كان عدد خلايا وضع العلامات BrdU مستقرا نسبيا مع أو بدون علاج HFS.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحديد موقع القطب الكهربائي بشكل صحيح ، وتقديم التحفيز بنجاح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب ، التحفيز عالي التردد المسجلين في النماذج. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيل التحفيز عالي التردد لنواة الدماغ العميقة.