حيث قمت بقص المسائل: تشريح وتحليل دليل للتوجه المكاني للشبكية الماوس من معالم بصري

الغرض من بروتوكول التشريح هذا هو توفير منهجية موحدة لاستخدام المعالم التشريحية للعين ، مثل عضلات المستقيم والشق المشيمي وتدرج S-opsin للاتجاه الطبوغرافي لشبكية الفأر. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها توفر طريقة موثوقة لتحديد القطبين الظهرية والبطنية والأنفية والزمنية لشبكية الفأر المعزولة بدقة. ابدأ بتحديد نقطة على القرنية الظهرية بالقرب من حدود الصلبة القرنية وبين القنطرة الأنفية والصدغية.

المس القرنية بقلم كي ساخن لمدة تقل عن ثانية لإنشاء علامة حروق لأغراض التوجيه. كرر للعين الثانية. يسمح وجود الحرق الظهري بتحديد العضلة المستقيمة العلوية.

للاستئصال ، استخدم ملقطا منحنيا لدفع العين برفق خارج تجويفها وإمساك الكرة الأرضية من الأسفل. بعد ذلك ، ارفع الكرة الأرضية ببطء من مقبسها مع تحريكها برفق في نفس الوقت من اليسار إلى اليمين حتى يتم تحرير الكرة الأرضية من المقبس. انقل الكرة الأرضية مع عضلات المستقيم المرفقة إلى طبق بتري يحتوي على وسط تشريح.

إذا كنت تعمل بكلتا العينين ، فتأكد من تتبع العين اليسرى والعين اليمنى. تحت نطاق التشريح ، حدد موقع حرق القرنية الظهرية بصريا وحدد العضلة المستقيمة العلوية التي ترتبط بها. باستخدام مقص تشريح أو إبرة قياس 20 ، قم بثقب القرنية عند علامة الحرق.

بعد ذلك ، قم بعمل قطع عميق في الكرة الأرضية باتجاه العصب البصري لتقسيم العضلة العلوية. تظهر هنا شبكية معزولة مع هذا القطع ، وتظهر شبكية العين المعاد بناؤها بهذا القطع هنا. استخدم مجموعتين من الملقط للبدء في عزل شبكية العين عن طريق تمزيق الثقب الذي تم إجراؤه بالثقب برفق حتى ينكشف جزء من شبكية العين.

بعد ذلك ، قم بفصل الشبكية عن الصلبة حتى تتم إزالة الصلبة بالكامل. قم بإزالة القزحية والعدسة والجسم الزجاجي وأي هياكل متبقية حتى يتم عزل شبكية العين تماما. يسمح وجود حرق ظهري بتحديد الشق المشيمي الأنفي والصدغي.

في حالة العمل بالعين اليمنى ، يقع الشق المشيمي الأنفي على يمين الحرق ويقع الشق المشيمي الصدغي على يسار الحرق. هذا عكس العمل بالعين اليسرى. لاستخدام معلم الشق المشيمي لتحديد اتجاه الشبكية ، حدد موقع الشق المشيمي في الجزء الخلفي من العين وتحديده.

قم بتوجيه الكرة الأرضية بحيث تقع علامة الحرق الظهرية في القطب العلوي ، كما لو كانت العين لا تزال في الفأر. بعد ذلك ، استخدم مقص تشريح أو إبرة قياس 20 لعمل ثقب واحد في الكرة الأرضية ، أولا حيث يوجد الحرق الظهري. بعد ذلك ، قم بعمل قطع ضحل باتجاه العصب البصري حيث يوجد حرق القرنية الظهري.

بعد ذلك ، قم بإجراء قطعتين عميقتين متساهلتين باتجاه العصب البصري. أحدهما عن طريق تبطين شفرات مقص التشريح بخط الشق المشيمي الصدغي في الجزء الخلفي من العين ، والآخر عن طريق تبطين شفرات مقص التشريح بخط الشق المشيمي الأنفي في الجزء الخلفي من العين. تظهر هذه الجروح هنا على شبكية معزولة ومعاد بناؤها.

بعد إجراء هذه التخفيضات ، استخدم مجموعتين من الملقط لتمزيق فتحات الثقب برفق حتى ينكشف جزء من شبكية العين. باستخدام مقص التشريح ، قم بعمل أربع جروح مخففة في شبكية العين حتى تستلقي بشكل مسطح. قم بتركيب شبكية العين ، جانب الخلية العقدية لأعلى ، على غشاء النيتروسليلوز عن طريق الضغط برفق على كل ركن من أركان شبكية العين على الغشاء باستخدام الملقط.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لغمر شبكية العين المركبة في مليلتر واحد من 4٪ بارافورمالدهايد الموجود في البئر الأول من صفيحة 24 بئرا. ضع اللوحة المكونة من 24 بئرا على شاكر مداري في درجة حرارة الغرفة وقم بتثبيت شبكية العين لمدة 40 دقيقة بالضبط. بعد التثبيت ، انقل شبكية العين إلى البئر الثاني من اللوحة ، المملوءة بمليلتر واحد من 0.1 مولار PBS واغسل شبكية العين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

عند اكتمال الغسيل ، انقل شبكية العين المثبتة إلى البئر الخامس الذي يحتوي على ملليلتر واحد من محلول الحجب واحتضانه طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، أضف الجسم المضاد الأساسي للأرانب المضاد ل S-opsin إلى محلول الحجب بتركيز واحد إلى 500 واحتضنه لمدة ثلاثة أيام عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة لمدة ثلاثة أيام ، اغسل الجسم المضاد الأساسي الزائد من شبكية العين ست مرات عن طريق وضعه بالتتابع في ستة آبار مملوءة بملليلتر واحد من PBS لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة.

ثم ضع شبكية العين المغسولة في بئر بمحلول مانع طازج وأضف الجسم المضاد الثانوي Alexa 594 المضاد للأرانب من الحمار. احتضان شبكية العين بالجسم المضاد الثانوي طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، اغسل شبكية العين في PBS ست مرات ، كما كان من قبل.

باستخدام ملقط ، انقل شبكية العين المثبتة إلى طبق بتري يحتوي على PBS. حرر شبكية العين من غشاء النيتروسليلوز عن طريق إدخال أطراف الملقط برفق بين الشبكية والغشاء حتى تختفي شبكية العين من الارتباط. اغمر شريحة مجهر زجاجي في PBS وقم بتركيب شبكية العين على الشريحة عن طريق تعويمها على الشريحة وحثها برفق بالملقط حتى تلتصق شبكية العين بالزجاج.

قم بتغطية شبكية العين على الشريحة بوسط تثبيت وضع غطاء 1.5. ضع الشريحة في صينية منزلقة واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد ساعة ، ضع صينية الشرائح على أربع درجات مئوية.

بعد تغطية الشريحة لمدة 24 ساعة ، استخدم طلاء الأظافر لإغلاق جوانب الشريحة لمنع الجفاف. هذا مثال على شبكية العين المعزولة من العين اليمنى التي تم تلطيخها مناعة لتسمية S-opsin وتصويرها بمجهر epifluorescence. من المهم ملاحظة أن الجروح في شبكية العين هذه تعسفية حيث يمكن تحديد الاتجاه الطبوغرافي من خلال التدرج S-opsin.

يمكن بعد ذلك إعادة بناء الصورة المكتسبة لشبكية العين رقميا باستخدام برنامج ReadiStruct. التخفيضات الأصلية باللون الأحمر الزائف في هذه الصورة. لاحظ أن ملف الإخراج لهذا البرنامج لا يقوم بمحاذاة شبكية العين بشكل صحيح.

بعد تشغيل شبكية العين من خلال رمز مختبر الحصيرة المخصص ، يتم تدوير شبكية العين بحيث يتم وضع أعلى تركيز من تلطيخ S-opsin في الأسفل وتحديده على أنه شبكية العين البطنية. تظهر هذه الصورة شبكية العين اليسرى. يقع القطب الصدغي عند 90 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة من القطب البطني ويقع القطب الأنفي على بعد 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة من القطب البطني.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنيات التشريح هذه بسرعة في بضع دقائق فقط إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توجيه شبكية العين بالفأر بدقة وموثوقية باستخدام العضلة المستقيمة العلوية أو الشق المشيمي أو تدرج S-opsin كمعلم بارز.