قاعدة البيانات--تسترشد التدفق الخلوي لتقييم نضج الخلية النقوي نخاع العظام
November 3rd, 2018
من الصعب تشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين في غياب المعايير المورفولوجية أو سيتوجينيتيكس غير مفيدة. MFC يمكن أن تساعد في تحسين عملية التشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. لتصبح مفيدة للممارسة السريرية، يجب أن تعتمد التحليل MFC على المعلمات مع خصوصية وحساسية كافية، وينبغي أن تكون البيانات قابل لإعادة الإنتاج بين مختلف العاملين.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تشخيص أمراض النخاع مثل متلازمات النخاع أو أمراض الدم الأخرى التي تتطور مع تشوهات النضج في أنساب الخلايا النخاعية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقلل من موضوعية المحقق في هذا التحليل والتفسير. ويمكن لهذه الطريقة أن توفر نظرة ثاقبة على المعايير الأكثر تميزا بالنسبة لنيلوسبلاسيا.
وهو يسمح بالتكون الكمي للاختلافات من مجموعات الخلايا النخاعية الطبيعية. ومن خلال هذا الإجراء، ستكون تيبهاني بيكو، زميلة ما بعد الدكتوراه من مختبرنا. تبدأ عن طريق خلط 600 ميكرولترات من عينة الخلية الأولية مع 10 ملليلتر من الغسيل العازلة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر لاثنين من الطرد المركزي و 10 ملليلتر من عازلة الغسيل الطازجة في الغسيل.
بعد الغسيل الثاني، إعادة تعليق بيليه في 400 ميكروليتر من العازلة الغسيل الطازجة، ونقل 350 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى أنبوب خمسة ملليلتر بولي بروبلين FACS، التي تحتوي على لوحة كاملة من الأجسام المضادة العمود الفقري. بعد خلط الخلايا بدقة، ماصة وحدات التخزين متساوية من حل الأجسام المضادة الخلية في ثلاثة أنابيب البولي بروبلين جديدة، وتقديم الحجم النهائي في كل أنبوب تصل إلى 200 ميكرولترات مع عازلة الغسيل الطازجة حسب الضرورة. بعد ذلك، إضافة الحجم المناسب من الأجسام المضادة ضد علامات سطح الخلية من الفائدة مع الاختلاط، لاحتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة ، أضف ميليتين من محلول المزيج مع الاختلاط ، لاحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، محمي من الضوء. جمع الخلايا الميّزة عن طريق الطرد المركزي، وتجاهل كل ما عدا آخر 50 ميكرولترات من عظمى في كل أنبوب، دون إزعاج بيليه. إعادة تعليق الكريات في كبرى المتبقية، مع خلط لطيف، وإضافة ملليلتر من عازلة الغسيل الطازجة إلى كل عينة.
بعد الغسيل الثاني، تخلص من المابير، تاركة ما يقرب من 50 ميكروليتر الحجم المتبقي في كل أنبوب، دون إزعاج بيليه. إعادة تعليق بيليه في 200 microliters من برنامج تلفزيوني مع الاختلاط، لتحليل فوري. لقراءة العينات على جهاز قياس تدفق، أولاً فتح تجربة جديدة في برنامج مقياس التدفق، وإعادة تسمية التجربة وفقاً لاسم ونوع العينة والتاريخ.
إنشاء عينة جديدة لثلاثة أنابيب، وتحديد الأجسام المضادة المستخدمة في كل أنبوب في تخطيط التجربة. افتح إعدادات مقياس المقاييس، وحدد إعدادات التطبيق، لتطبيق القيم التي تم الحصول عليها في الإعداد الشهري. افتح ورقة عمل عالمية جديدة وأنشئ قطع نقطة مناسبة لـ gating الخلايا المفردة، وكذلك للسكان الحبيبيات، أحادية، الانفجار، والخلايا اللمفاوية.
إنشاء ورقة عمل عمومية جديدة لعناصر التحكم في التعويض. ثم، الحصول على 500،000 الأحداث من كل أنبوب، بمعدل اقتناء متوسطة، وتصدير البيانات كملفات fcs 3.0، بعد التحقق من صحتها التقنية. قبل البدء في تحليل جديد، قم بتنزيل ملفات الخلايا التي تحتوي على بيانات نخاع العظم العادية، للعدلات، أحادية، وأنساب حمراء نوية، وملفات التحليل في شكل INP.
ثم احفظ البيانات على سطح المكتب. من أجل حفظ نضوج العدلات إلى قاعدة البيانات، أولاً فتح برنامج Infinicyt ثم قم بفتح ملف الخلايا المقابلة لبيانات نضوج العدلات. رسم مسار النضج على الرسم البياني APS، وحفظ مسار نضوج العدلات إلى قاعدة البيانات.
فتح ملف fcs لنضوج النسب العدلات التي يجب تحليلها. تحميل ملف inp نضوج العدلات من علامة التبويب ملفات التعريف. وينقسم تحليل هذا النسب إلى ثلاث خطوات.
ابدأ باختيار التفجيرات الإيجابية التي تُرتكب في CD34. لهذا الهدف ، واستخدام تقاطع سبع بوابات ، للسماح لاختيار CD34 إيجابية ، CD117 إيجابية ، HLADR منخفضة ، CD10 السلبية ، CD13 إيجابية ، CD11 ب السلبية الأحداث. مواصلة التحليل مع اختيار CD117 إيجابية, CD34 السلائف العدلات السلبية.
مواصلة التحليل مع اختيار خلايا العدلات أكثر نضجا. المقبل، وتظهر تحليل خلايا النسب أحادية. رسم مسار النضج على الرسم البياني APS.
تحقق من أن السهم يشير إلى الشعور بالنضج موجه من خلايا غير ناضجة، أحادية، CD14 سلبية، IREM2 سلبية، إلى أحاديات ناضجة، CD14 إيجابية، IREM2 إيجابية. حفظ مسار نضوج النسب أحادية إلى قاعدة البيانات. فتح ملف fcs لنضوج النسب أحادية التي يجب تحليلها.
قم بتحميل ملف التعريف لتحليل النسب الأحادي. لتحديد خلايا النسب أحادية، استخدم تقاطع أربع بوابات التي تسمح باختيار CD64 إيجابية عالية، CD117 إيجابية، CD117 السلبية، HLADR الأحداث الإيجابية. تعيين هذه الأحداث إلى علامة التبويب أحادية في شجرة التسلسل الهرمي للفئات.
افتح ملف cyt NRC الذي يجب حفظه في قاعدة بيانات NRC. رسم مسار النضج على الرسم البياني APS، وحفظ الخلايا الحمراء النووية نضوج المسار إلى قاعدة البيانات. افتح ملف fcs الذي يجب تحليله.
تحميل من التشكيلات قالب تحليل الخلايا الحمراء النووية. وينقسم تحليل هذا النسب إلى خطوتين. بدءا من اختيار CD34 إيجابية ، إريثرويد التفجيرات ارتكبت.
هنا ، استخدم تقاطع سبع بوابات للسماح باختيار CD34 إيجابية ، CD117 إيجابية ، HLADR منخفضة ، CD105 إيجابية ، CD33 السلبية ، CD36 إيجابية ، CD71 الأحداث الإيجابية. تعيين هذه الأحداث إلى علامة التبويب NRC في التسلسل الهرمي للفئات. إزالة انفجار 34 erythroid إيجابية ارتكبت من الرؤية.
لتحديد خلايا erythroid أكثر نضجا ، واستخدام تقاطع أربع بوابات التي تسمح التمييز من CD45 السلبية وD45 إيجابية منخفضة ، الجانب مبعثر منخفضة ، CD36 عالية إيجابية ، و CD71 إيجابية عالية. ثم، إزالة الجانب CD36 عالية مبعثر الصفائح الدموية المنخفضة من الخلايا الحمراء النووية، وتعيين هذه السكان إلى علامة التبويب NRC. لتقييم النضج النخاعي في حجرة نخاع العظام، افتح ملف الخلايا المقابلة ل نسب الاهتمام من الحالة التي يجب تقييمها.
الاحتفاظ بالأحداث المعينة إلى علامة التبويب العدلات في شجرة التسلسل الهرمي للفئات فقط مرئية. رسم مسار النضج على الرسم البياني APS وتحميل قاعدة البيانات المقابلة لنضوج العدلات في نخاع العظام العادي، ومقارنة البيانات. إذا كانت البيانات متوافقة جزئياً على الأقل، سيقوم البرنامج بإنشاء مخطط اختلافات نضوج تطبيع، و شريط معلمة، لتصور الاختلافات النضج.
لمقارنة نضوج أحاديات في حجرة نخاع العظام، بالنسبة لحالة جديدة مع البيانات من نخاع العظام العادي، بما في ذلك في قاعدة بيانات أحادية الخلايا، افتح ملف الخلايا المُقابلة لـ سلالة الخلايا الأحادية. الاحتفاظ بالأحداث المعينة إلى علامة التبويب أحادية في شجرة التسلسل الهرمي للسكان مرئية، ورسم مسار النضج على الرسم البياني APS. قم بتحميل قاعدة البيانات المطابقة لنضوج أحاديات في نخاع العظم العادي، وقارن البيانات.
لمقارنة الخلايا الحمراء المنضجة في حجرة نخاع العظم، بالنسبة لحالة جديدة، مع بيانات من نخاع العظم العادي، المدرجة في قاعدة بيانات NRC، افتح ملف الخلايا التي تتوافق مع نسب NRC. الاحتفاظ بالأحداث المعينة إلى علامة التبويب NRC في شجرة التسلسل الهرمي للفئات مرئية فقط. ورسم مسار النضج على الرسم البياني APS.
قم بتحميل قاعدة البيانات المطابقة لنضوج NRC في نخاع العظم العادي، وقارن البيانات. ثم، لتصور أهمية الاختلافات بين الملف الجديد والبيانات المضمنة في قاعدة البيانات، انقر فوق اختلافات النضوج المُتسوى والتكبير. تذكر أن الأساليب التي تستخدم خوارزميات التصنيف الهرمي في تحليل البيانات الخلوية التدفقية ذاتية للغاية وغير دقيقة بطبيعتها ، لأنها لا تحسب تداخل مجموعات الخلايا.
تقييم الحالات الجديدة من السيتوبينيا، يشتبه في أن MDS ضد قواعد بيانات النضج الطبيعي النخاعي، تسمح لتحديد مستضدات النضج غير طبيعية التعبير عنها من العدلات، monocyte، وNRC النسب، حتى في الحالات دون تشوهات الخلايا أو الخلايا. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن نكتسب البيانات السيتوميترية تدفق، بطريقة موحدة، لأداء إعداد الإعداد cytometer الشهرية، والشيكات اليومية، إلى ماصة بدقة الأجسام المضادة قبل الاستخدام، واحترام الأوقات تلطيخ. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل البوصلة، لمقارنة مجموعة مختلفة من الحالات، والإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما هي بصمة الطابعة النهائية لمجموعة معينة من الحالات.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين المهتمين باستكشاف أنماط نضوج الخلايا النخاعية ، في حالات الدم الانسيابي من الإمكانات غير المتخصصة لتحديد التغييرات الطابعية النهائية ذات الصلة بشكل موثوق لعملية dysplastic. يرجى ملاحظة أن تحديث قاعدة البيانات مع زيادة عدد البيانات من الجهات المانحة السليمة قد يحسن من قوة التحليل.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تناقش هذه المقالة استخدام قياس الخلايا المتدفقة متعددة المعلمات (MFC) لتعزيز عملية التشخيص لمتلازمات خلل التنسج النقوي (MDS). تسلط الضوء على أهمية الخصوصية والحساسية في تحليل MFC للتطبيقات السريرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الدم
- الأمراض النقوية
- تقنيات التشخيص
الخلفية
- تشخيص MDS تحدي بدون معايير شكلية.
- تعقيدات علم الوراثة غير الإرشادية لعملية التشخيص.
- يمكن أن يعمل MFC على تحسين عملية تشخيص MDS.
- تكرار البيانات بين المشغلين أمر حاسم.
هدف الدراسة
- لتقييم فعالية MFC في تشخيص الأمراض النقوية.
- لتحديد المعلمات الأكثر تميزًا لخلل التنسج النقوي.
- لتقليل الذاتية في التحليل والتفسير.
الطرق المستخدمة
- خلط عينات الخلايا الأولية مع محلول الغسيل.
- إجراء عمليات الطرد المركزي لتحضير العينة.
- تحديد الاختلافات من مجموعات الخلايا النقوية الطبيعية.
- عرض الإجراء من قبل زميل ما بعد الدكتوراه.
النتائج الرئيسية
- يوفر MFC رؤى حول الاختلافات في مجموعات الخلايا النقوية.
- تعمل التقنية على تقليل الذاتية للباحث.
- تسمح بتحديد كمي للمعلمات التمييزية.
- يتم التأكيد على تكرار البيانات لفائدة سريرية.
الاستنتاجات
- يمكن أن يعزز MFC دقة التشخيص لـ MDS.
- الخصوصية والحساسية أمران حاسمان للتطبيق السريري.
- تحتاج التحقق الإضافي لاستخدامها على نطاق واسع في الممارسة السريرية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Standardized flow cytometry databases for myeloid maturation enable objective, quantitative assessment of hematologic dysplasia, reducing investigator subjectivity in diagnostic interpretation. This approach supports early detection of myelodysplastic syndromes by identifying phenotypic deviations from healthy donor baselines, enhancing diagnostic confidence in preclinical and translational hematology research. The method facilitates cross-laboratory reproducibility, a critical factor for biomarker validation and assay transfer in drug discovery pipelines targeting myeloid malignancies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myeloid differentiation pathways through quantitative comparison of cell maturation profiles against established normal baselines.
- Operational Value: Reduces analytical variability in target validation studies by minimizing subjectivity in flow cytometric gating and interpretation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying early maturation defects in preclinical models of hematopoietic disorders.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a framework for assay standardization using lineage-specific maturation databases to ensure consistent phenotypic readouts across screening campaigns.
- Operational Value: Enables robust quantitative outputs for compound effect assessment on myeloid differentiation, supporting hit-to-lead progression.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream applications by establishing normalized maturation trajectories.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by allowing direct comparison of experimental models to healthy human myeloid maturation benchmarks.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lineage-specific phenotypic abnormalities that may serve as translational biomarkers in myeloid disease models.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on maturation deviation thresholds (e.g., 2SD from normal) in preclinical efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow by providing standardized phenotypic readouts that inform target validation, assay development, and preclinical model qualification for myeloid-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of myeloid differentiation pathways through objective, database-referenced maturation analysis.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility by anchoring compound-induced phenotypic changes to established normal maturation baselines.
- Analytics: Generates quantitative maturation difference diagrams and parameter bands that allow statistical comparison of experimental conditions against healthy donor data.
- Translational Research: Connects in vitro or in vivo findings to human-relevant myeloid maturation standards, supporting preclinical-to-clinical translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical framework for consistent myeloid maturation assessment across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in myeloid differentiation assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of flow cytometry assays through standardized database-driven analysis.
- Strategic Value: Improves portfolio decision-making by enabling objective, quantitative evaluation of myeloid dysplasia risk in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on myeloid maturation trajectories.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiparameter flow cytometry and hematologic marker panels for myeloid lineage identification.
- Depends on access to validated antibody panels and standardized instrument setup protocols for reproducible data acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, staining, and acquisition protocols to ensure database comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-human model systems or alternative maturation markers.
- Limited by inter-laboratory variability in antibody performance, particularly those derived from hybridoma technologies, which may affect data harmonization.
