How does histotypic tissue culture differ from traditional two-dimensional cell culture?

Histotypic tissue culture grows cells in three dimensions on engineered scaffolds, creating dense cell networks that mimic native tissue morphology and function. Unlike two-dimensional culture on flat substrates, 3D culture maintains cell phenotype, organ-specific functions, and realistic intercellular communication pathways, making it superior for tissue engineering and regenerative medicine applications.

What role does the scaffold play in histotypic tissue culture?

The scaffold is a three-dimensional porous matrix that mimics the natural extracellular matrix, providing structural support and a template for cells to grow in high density. Scaffolds can be designed from various polymer networks, including hydrogels and electrospun silk mats, and are tailored to specific cell types and applications to support bio-mimetic tissue development.

How are primary cells isolated from donor tissue for culture?

Primary cells are harvested by mincing donor tissue into small pieces and digesting them in an enzyme solution, typically collagenase, to separate target cells from the extracellular matrix. The tissue is shaken at body temperature, gently pipetted to break up pieces, and the supernatant containing isolated cells is collected and treated with a stop solution to halt digestion.

What are the two main techniques for seeding cells onto tissue scaffolds?

The droplet technique involves slowly pipetting a cell solution onto the scaffold at a constant rate, while the cell suspension technique submerges the scaffold in cell suspension, often with shaking to encourage cell migration into the matrix. Both methods produce bio-engineered constructs with high cell densities suitable for tissue repair and regeneration.

How is a porous silk scaffold fabricated for tissue culture?

Silk solution is poured into a mold, salt particles are scattered over it, and the mixture polymerizes at room temperature for 48 hours. The mold is then heated to finalize cross-linking, immersed in distilled water to leach out salt, and the resulting scaffold is cut into discs and rings using biopsy punches before autoclaving for sterilization.

What practical applications does histotypic tissue culture enable in bioengineering?

Histotypic tissue culture creates cellular microenvironments for studying stem cell differentiation, screening biological cues, and enhancing tissue regeneration. Mechanical conditioning can precondition scaffolds to mimic native tissue structure, and vascularized constructs can be implanted to repair tissue defects, with success confirmed through histological analysis.

Why is maintaining the native tissue phenotype important in engineered tissue constructs?

Maintaining native phenotype ensures cells retain organ-specific functions and realistic intercellular networks necessary for successful tissue repair and implantation. Three-dimensional culture preserves cell morphology and communication pathways that two-dimensional systems cannot support, resulting in constructs that more closely resemble natural tissue and function effectively when grafted.

زراعة الأنسجة النسيجية

0 مشاهدة09:35 دقيقة

تسمح زراعة الأنسجة النسيجية بزراعة الخلايا في ثلاثة أبعاد ، وبالتالي إنشاء أشكال أنسجة في المختبر تحاكي عن كثب وظيفة الأنسجة الواقعية ، والتي يمكن استخدامها كتركيبات قابلة للتطبيق لإصلاح الأنسجة. عادة ما تكون هذه الثقافات عبارة عن هياكل ثلاثية الأبعاد تتكون من نوع خلية واحدة ينمو بكثافة عالية. يحاكي الهيكل ثلاثي الأبعاد ، المعروف أيضا باسم السقالة ، المصفوفة الطبيعية خارج الخلية. اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة ، يمكن تصميم السقالات لتطبيق معين وعادة ما تكون بمثابة قالب للأنسجة المقلدة الحيوية. سيقدم هذا الفيديو أساسيات مزارع الأنسجة النسيجية ، وإجراء لعزل الخلايا ، وتصنيع وسليل سقالة أنسجة الحرير المسامية لتقليد أنسجة القلب.

تتكون جميع الأنسجة من مكونين أساسيين ، المصفوفة خارج الخلية والخلايا الخاصة بالأنسجة التي تسكنها. المصفوفة خارج الخلية عبارة عن شبكة من البروتينات الهيكلية التي تخلق بيئة ثلاثية الأبعاد للخلايا لتشغلها ، وتهدف الخلايا الموجودة بداخلها إلى تلخيص العمليات الفسيولوجية الأصلية للأنسجة. حاليا ، هناك تقنية شائعة تستخدم لنمذجة الأنسجة وهي زراعة الأنسجة ثنائية الأبعاد ، حيث يتم توزيع الخلايا على ركيزة مسطحة ويسمح لها بتكوين طبقة رقيقة. بشكل عام ، لا يمكن الاعتماد على هذه الطريقة للحفاظ على النمط الظاهري في الجسم الحي ، والوظائف الخاصة بالأعضاء ، والتفاعلات السياقية من خلية إلى خلية أو خلية إلى ركيزة. تخفف ثقافة الأنسجة النسيجية من هذه القيود من خلال توفير سقالة ثلاثية الأبعاد لتنمو الخلايا ، مما ينتج عنه شبكة كثيفة من الخلايا تحاكي عن كثب أشكال الخلايا الأصلية وتسهل تطوير شبكات واقعية بين الخلايا ومسارات الاتصال. توفر مجموعة متنوعة من شبكات البوليمر ثلاثية الأبعاد ، بما في ذلك الهلاميات المائية والحصائر الحريرية الكهربائية ، طرقا ملائمة لزراعة الخلايا الخاصة بالأنسجة في ثلاثة أبعاد. من أجل ملء هذه السقالات ، يجب عزل الخلايا. يتم حصاد الخلايا الأولية المستخدمة في هذا الفيديو من الأنسجة الحية ، والتي يتم فرمها ثم هضمها في محلول إنزيمي لفصل الخلايا المستهدفة عن المصفوفة خارج الخلية. بمجرد عزل الخلايا ، هناك طريقتان تستخدمان لزرع السقالات. تتضمن تقنية القطرات سحب محلول من الخلايا على السقالة بمعدل بطيء وثابت. الثانية ، أو تقنية تعليق الخلية ، تغمر السقالة في معلق الخلية. في كثير من الأحيان ، يتم اهتزاز السقالة والتعليق لتشجيع هجرة الخلايا إلى المصفوفة. تؤدي كلتا التقنيتين إلى تركيبات هندسية حيوية ذات كثافة خلايا عالية. ستتضمن الإجراءات التالية عزل خلايا القلب وتقنية تعليق الخلايا لإنشاء سقالة خاصة بخلايا القلب ، حيث ستحتفظ بمورفولوجيا أنسجة القلب الأصلية.

لبدء عملية عزل الخلايا عن الأنسجة المانحة ، ابدأ بالتأكد من تعقيم منطقة العمل وأدوات التشريح. ثم ضع ستارة معقمة على سطح العمل في خزانة السلامة الحيوية. ضع الأدوات الجراحية المعقمة على الستارة دون لمسها ، ثم افتح شفرة مشرط معقمة رقم 20. بعد القتل الرحيم للعينة ، قم بتعقيم المنطقة الجراحية باستخدام وسادة شاش مبللة بالبيتادين. عندما تصبح جاهزا ، قم بتأمين العينة وابدأ العملية الجراحية لعزل الأنسجة ذات الاهتمام. في هذه الحالة ، سيكون القلب. بمجرد استئصالها ، ضع الأنسجة على الثلج في طبق بتري الذي يحتوي على جلوكوز PBS. قم بإزالة أي دم متبقي أو نسيج ضام ، ثم انقل الأنسجة إلى طبق بتري مع جلوكوز PBS الطازج. بعد ذلك ، باستخدام مقص دقيق معقم وملقط ، قم بفرم عينات الأنسجة بعناية إلى قطع 1 مليمتر مكعب تقريبا. باستخدام ماصة ، انقل القطع والعازلة إلى أنبوب مخروطي الشكل. ثم قم بإزالة كل المخزن المؤقت باستثناء 10 ملليلتر. أضف 7 مل من محلول الكولاجيناز ، ثم رج الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. ثم قم بتقطيع الماصة برفق 10 مرات لتفتيت قطع الأنسجة. اترك القطع تستقر ، ثم استنشق السائل وتخلص منه. بعد ذلك ، كرر عملية الهضم وقم بماصة المحلول برفق لتفتيت قطع الأنسجة. بعد أن تستقر القطع ، اسحب المادة الطافية واجمعها في أنبوب مخروطي منفصل سعة 50 مل. ثم أضف 10 مل من محلول STOP إلى كل أنبوب مخروطي يحتوي على مادة طافية لوقف الهضم.

الآن بعد أن تم عزل الخلايا الأولية ، دعنا نصنع سقالة من أنسجة الحرير المسامية. للبدء ، صب 30 مل من محلول الحرير في قالب. بعد ذلك ، نثر 60 جراما من كلوريد الصوديوم المنخل بالتساوي على المحلول. ثم اترك الحرير يتبلمر دون إزعاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة. ثم ضع القالب في فرن 60 درجة لمدة 1 ساعة لإنهاء الربط المتقاطع وتبخير أي سائل متبقي. بمجرد البلمرة ، اغمر القالب في دورق من الماء المقطر لمدة 48 ساعة لإخراج الملح. ثم قم بإزالة السقالة من القالب وقطع الأقراص الصغيرة باستخدام خزعة 5 ملم. قم بقص الأقراص على ارتفاع 2 ملم ، وأخيرا ، قم بإزالة مراكز كل قطعة باستخدام لكمة خزعة 2 ملم لإنشاء حلقة. أخيرا ، قم بتعقيم السقالات في دورة رطبة لمدة 20 دقيقة.

مع تحضير السقالة ، لنبدأ عملية بذر الخلايا. أولا ، ضع سقالة معقمة واحدة لكل بئر في طبق 96 بئر. بعد ذلك ، أضف وسط زراعة الخلايا لغمر السقالات واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة لتوازنها لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد الحضانة ، استنشق الوسط الزائد ثم أضف تعليق الخلية الأولية المعزولة إلى السقالات. بعد ذلك ، أعد اللوحة إلى الحاضنة واتركها طوال الليل حتى تلتصق الخلايا بالسقالات. في صباح اليوم التالي ، قم بشفط الخلايا غير المرفقة بعناية واستبدلها ب 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الطازجة لكل بئر. السقالة الناتجة عبارة عن بنية مسامية ذات كثافة خلوية عالية جاهزة للاستخدام.

الآن بعد أن تعلمت كيفية إجراء زراعة الأنسجة النسيجية ، دعنا نلقي نظرة على بعض التطبيقات العملية لهذه المواد. يمكن لثقافة الأنسجة النسيجية أن تخلق بيئات دقيقة خلوية تحاكي الأنسجة الأصلية ، ونتيجة لذلك فهي قادرة على توفير نموذج مناسب لدراسة السلوك الخلوي فيما يتعلق بنوع خلية واحدة. على سبيل المثال ، يمكن زرع الألياف ثلاثية الأبعاد في السقالات ، والتي تحاكي بشكل أكثر دقة مكانة الخلايا الجذعية الموجودة في الجسم الحي ، بخلايا جذعية متعددة القدرات للكشف عن الإشارات البيولوجية وتحديد آثارها على تمايز الخلايا الجذعية. قد يوفر هذا العمل في النهاية فهما أكبر لكيفية تمايز الخلايا الجذعية وقد يقدم رؤى حول تعزيز تمايز الخلايا وتجديدها لتطبيقات هندسة الأنسجة. مثل الثقافات الديناميكية ، يمكن للتكييف الميكانيكي أيضا تعزيز سقالة الأنسجة ثلاثية الأبعاد من خلال تعريضها لأحمال ميكانيكية مختلفة قد تواجهها الأنسجة الطبيعية في الجسم الحي. من خلال تطبيق الضغط والأحمال ثنائية المحور أثناء نمو الخلية ، يتم تغيير مورفولوجيا الخلية والمصفوفة خارج الخلية لتعكس تلك الأحمال الميكانيكية. ينتج عن هذا سقالة أنسجة مكيفة بيولوجيا مكيفة مسبقا ببنية خلوية تشبه الأنسجة الأصلية ، مما يجعلها مثالية للزرع في المناطق التي قد تواجه قوى ميكانيكية مماثلة. أخيرا ، يمكن أيضا استخدام تركيبات الأنسجة الهندسية لاستبدال أو إصلاح عيوب الأنسجة. من أجل تحقيق ذلك ، يجب أولا تحويل سقالة الأنسجة إلى الأوعية الدموية ، مما يسمح للدم بالتحرك بحرية عبر البناء. بمجرد تحويل الأوعية الدموية ، يمكن نقل السقالة وزرعها في عيب الأنسجة لبدء الإصلاح. يمكن تأكيد التطعيم الناجح لاحقا من خلال علم الأنسجة ، والذي يكشف ما إذا كان بناء الأنسجة قد أصلح المنطقة المتضررة بالكامل أم لا.

لقد شاهدت للتو مقدمة جوف لثقافة الأنسجة النسيجية. يجب أن تفهم الآن كيفية إعداد الهياكل ثلاثية الأبعاد البسيطة ، وكيف يتم عزل الخلايا الأولية وزرعها على سقالة ، والتطبيقات المختلفة لهذه الثقافات في مجال الهندسة الحيوية. شكرا للمشاهدة.

على الرغم من أن زراعة الأنسجة ثنائية الأبعاد كانت شائعة لبعض الوقت ، إلا أن الخلايا تتصرف بشكل أكثر واقعية في ثقافة ثلاثية الأبعاد ، وتحاكي الأنسجة ال…